论文部分内容阅读
牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)与槲皮素(Quercetin, QUE)纳米颗粒的形成机理、稳定性和肠细胞吸收的研究对于生物活性大分子与生物小分子纳米颗粒的形成及其功能改变具有一定理论和实际意义。本文首先分析比较了QUE及花青素(Anthocyanin, ACN)两种不同性质生物活性小分子(脂溶性QUE及水溶性ACN)与BSA相互作用及纳米颗粒的不同特征;其次研究了BSA-QUE纳米颗粒在不同条件下,如pH、时间、温度和化学处理对其相互作用形成纳米颗粒的影响；同时研究了BSA-QUE纳米颗粒对肠细胞生长的影响；最后研究了BSA-QUE纳米颗粒在Caco-2细胞的摄入和在Caco-2单细胞层的吸收。荧光光谱的结果表明QUE对BSA有较强的荧光猝灭作用,且为静态与动态并存的复合猝灭方式,相互作用力为疏水作用力；ACN对BSA有荧光猝灭作用,猝灭程度小于QUE对BSA的猝灭,为静态猝灭方式,相互作用力为氢键和范德华力。BSA和QUE及ACN相互作用形成纳米颗粒,且BSA与QUE的结合力大于BSA与ACN的结合力,BSA-QUE纳米颗粒比BSA-ACN纳米颗粒更稳定。在PBS (pH7.4)中,BSA-QUE和BSA-ACN纳米颗粒的大小分别为42.53nm和53.68nm；电势分别为-25.64mV和-21.50mV。与BSA相互作用后的QUE及ACN的自由基清除率均小于QUE及ACN,由于QUE及ACN分子上的羟基-参与和BSA的相互作用,导致其抗氧化活性的屏蔽。紫外可见光谱的结果表明在pH2.5、5.0和6.0溶液中,QUE在250-500nm范围无明显吸收峰,BSA-QUE有2个明显吸收峰；在pH7.4和8.0溶液中,QUE和BSA-QUE均有3个明显吸收峰。BSA和QUE相互作用形成粒径约为10nm和大于100nm的颗粒,随着pH的增大,粒径大于100nm的颗粒所占比例逐渐减小。在不同pH溶液中,与BSA相互作用后的QUE的自由基清除率均小于QUE,但在pH8.0溶液中,减小程度最小。在4℃,25℃和37℃温度条件下,随着时间的延长,粒径小于50nm颗粒所占比例逐渐减小;半胱氨酸(Cysteine, Cys)还原BSA(cBSA)和QUE相互作用形成cBSA-QUE纳米颗粒,且对QUE的结合量大于BSA-QUE中QUE的结合量。细胞存活率实验表明随着QUE和BSA-QUE浓度的升高和作用时间的延长,Caco-2细胞存活率逐渐减小。当作用时间为1h时,随着QUE和BSA-QUE浓度的增加,Caco-2细胞存活率从100%分别减小到79.52%和84.26%；作用时间为2h时,细胞存活率减小到68.65%和61.54%;作用时间为3h时,细胞存活率减小到49.04%和41.73%。当作用时间为1h,2h和3h时,BSA-QUE处理细胞的乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)释放率分别为108.05%,196.55%,274.71%。与对照组细胞相比,经BSA-QUE处理的细胞,G1期的细胞量变大,G2期的细胞减少,S期的细胞量减少；早期和晚期凋亡的细胞逐渐增加,分别从7.70%增加到25.83%,从0.04%增加到25.36%。采用激光共聚焦显微镜观察FITC标记的BSA-QUE纳米颗粒可被Caco-2细胞摄取,分布于细胞核区域,随着时间的延长,细胞核区域及周围荧光强度增强。QUE和BSA-QUE在Caco-2单细胞层吸收过程中,透过室QUE含量均呈现明显的时间依赖性。180min内,BSA-QUE中QUE透过量随着时间的延长持续增大,且任一时间点与前一时间点比较均有显著差别。和QUE相比,30min时,QUE透过量无显著差异,其余时间点BSA-QUE中QUE透过量均大于单独QUE。