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[背景]慢性便秘（chronic constipation,CC）是全球性的常见病和慢性病。我国CC的患病率约为6%（约8千万人）;男女比例约为1:2.3,育龄期和妊娠期妇女发病率更高。研究发现:健康女性较男性的结肠传输时间长,妇女妊娠期更多有结肠传输时间延长、排便次数减少。雌激素与特异性受体结合发挥作用:经典的雌激素受体（estrogen receptor,ER）α和β位于细胞核或胞浆内（称之核受体）,雌激素与ERα/β结合,易位至胞核,调节有活性的mRNA或蛋白的表达,称为雌激素的“基因组作用”。另一种G蛋白偶联的ER（G proteincoupled estrogen receptor,GPER）位于细胞膜,结合雌激素后,GPER构象变化、调节离子通道、G蛋白和酪氨酸激酶,产生快速生物学效应,称为雌激素的“非基因组作用”。平滑肌细胞（smooth muscle cells,SMCs）中Ca2+浓度是平滑肌收缩的基础。研究认为,雌激素通过“非基因组作用”抑制胞膜Ca2+通道,阻止胞外Ca2+内流、导致平滑肌舒张。小电导钙激活钾通道(small conductance Ca2+-activated K+channels,SK)是一种Ca2+依赖型的K+通道,参与慢后超极化电位的产生。已发现SK参与血管、支气管、膀胱、子宫、结肠等部位平滑肌的舒张机制。SK家族包括SK1、SK2和SK3,其中SK3在结肠SMC表达丰富。本课题组前期研究证实:在结肠SMC水平上ERα介导了雌二醇（E2）对SK3的促表达作用（基因组作用）。另有研究证实:雌激素可通过特异性蛋白转录因子（specificity protein transcription factors,Sp）1 和3 调节L6细胞系及子宫SMC内SK3编码基因KCNN3的转录。基于以上背景,本课题拟探讨SK3表达在雌二醇介导的大鼠结肠平滑肌收缩中的作用,为更多的女性便秘患者提供新的治疗思考。[目的]1、观察E2慢性刺激对大鼠结肠平滑肌SK3表达、平滑肌收缩的影响,验证雌激素核受体介导的E2“基因组作用”。2、E2干预及SK3过表达、对大鼠结肠SMC钙动员的影响。3、探讨E2促大鼠SMC膜SK3表达的受体后信号通路。[方法]1、动物分组及干预（1）雌性SD大鼠,手术去除双侧卵巢,随机分为正常对照组、E2组、雌激素抑制剂组（EI）及BSA-E2组:皮下均埋置硅胶管;正常对照组给予空白溶剂;E2组给予0.3mg/mL的E2,使E2组血清E2保持在生理浓度;EI组给予相同浓度E2及E2抑制剂（ICI 182780）;BSA-E2组给予BSA-E2（仅有非基因组效应）。ELISA试剂盒检测所有大鼠血清E2浓度。（2）结肠标本采集:以上干预14天后处死,剪取结肠肌条,免疫荧光及Western Blot检测各组肌条中SK3蛋白分布及表达,MPA分析系统检测肌条收缩强度。2、原代结肠SMCs的分离及培养（1）分离结肠SMCs:雌性SD大鼠断颈处死,快速剖腹剪取结肠组织,去除粘膜及浆膜层、剪碎平滑肌组织,常规消化、离心,含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞、过筛;于37℃、95%O2和5%CO2条件下培养。（2）检测E2刺激后对结肠SMC钙动员的影响:SMC经50nmol/L的E2孵育24h后,激光共聚焦扫描显微镜检测CCh刺激后SMC胞内Ca2+浓度。（3）检测过表达SK3后对结肠SMC钙动员的影响:过表达SK3后,激光共聚焦扫描显微镜检测CCh刺激后SMC胞内Ca2+浓度。（4）检测E2的受体后信号通路:SMC分别给予溶剂、E2、E2和ICI 182780（E2抑制剂）孵育24h后,Western Blot及qPCR检测各组转录因子Sp1及Sp3表达。[结果]1、各组结肠肌条SK3分布及表达:E2组SK3表达较其他各组均显著增加（1.46±0.344 vs 0.67±0.143,0.51±0.066,0.62±0.225,P<0.05）,BSA-E2 组 SK3 表达水平与对照组及EI组无明显差异（0.62±0.225 vs 0.67±0.143,0.51±0.066,P>0.05）。2、各组结肠肌条收缩强度:E2组结肠平滑肌收缩较其他各组显著下降（1.88±0.244 vs 4.09±0.405,4.70±1.269,4.57±0.392,P<0.05）。BSA-E2 组与对照组及 EI 组无明显差异（4.57±0.392 vs 4.09±0.405,4.70±1.269,P>0.05）。3、E2刺激及过表达SK3对结肠SMC钙动员影响:E2刺激后,对CCh钙动员的反应明显下降,胞内钙离子浓度的上升幅度显著低于对照组（1.085±0.68 vs 2.021±0.384,P=0.001）。CCh刺激后,过表达SK3组SMC胞内钙的上升幅度显著低于转染试剂对照组和空载组（1.478±0.260 vs 0.690±0.140,1.070±0.149,P<0.05）。4、E2刺激对Sp1及Sp3影响:E2组Sp1 RNA表达较溶剂对照及抑制剂组显著升高（1.44±0.012 vs 0.76±0.169,P<0.05）,Sp3 RNA表达较溶剂对照及抑制剂组降低（0.60±0.065 vs 1.02±0.043,P<0.05）。E2组Sp1蛋白表达较其他组升高、但无明显差异（1.62±0.060 vs 1.42±0.171,1.40±0109,P>0.05）,Sp3 蛋白表达较其他各组显著降低（1.34±0.246 vs 3.70±0.339,4.97±0.564,P<0.01）。[结论]1、E2慢性刺激主要通过其“基因组作用”促结肠平滑肌SK3表达升高,结肠肌条收缩降低。2、E2促SK3表达可降低结肠SMC胞内钙动员。3、E2刺激后、核转录因子Sp1表达升高、并Sp3表达降低,均促SK3表达。