CMV-CP基因高效表达与抗血清的制备

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根据已报道的CMV-CP基因序列,设计一对引物,从含CMV-CP蛋白基因的重组质粒pBIC中,通过PCR扩增得到大小为657nt的CMV-CP基因,并把它重组到细菌表达载体pET-22b(+)中。酶切鉴定及序列测定表明,重组表达质粒pET-22b-CP连接区域符合设计要求,具有正确的开放阅读框架,插入片段含有218个氨基酸的完整编码区,其核苷酸序列与报道的CMV-CP基因的同源性为100%。重组表达载体导入宿主菌E.coli BL21(DE3),用终浓度为1mmol/L IPTG诱导,37℃培养6小时后,CP基因的表达量达到最高,每毫升菌液含目的蛋白的量约为2mg;UVi光密度扫描分析表明CP基因的表达量占细菌总蛋白的28.9%。SDS-PAGE电泳后,将表达的CP蛋白切胶回收,研磨成粉后加入等体积的福氏不完全佐剂,乳化制备成抗原。采用多点皮下注射法免疫家兔,每隔7天注射一次,共注射4次,每次免疫剂量为2ml抗原(含300μg的CP蛋白)。最后一次注射后10天,采用颈动脉采血法获得抗血清。ELISA实验表明:该抗血清的效价为1:10000。检测反应与CMV病毒具有较高的专化性,与异源病毒没有交叉反应,非特异性反应较低。本实验结果为今后开展CMV的快速、有效的检测奠定了基础,同时为外源基因的大量表达及利用表达产物制备抗血清积累了一定的经验。
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