柱型苹果MdCoL基因表达特性分析及功能验证

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柱型苹果(Columnar apple)树体矮生,节间短,长分枝少,是苹果育种的珍贵资源。挖掘柱型Co基因以及探索其调控机理,对揭示柱型苹果柱型性状的形成及选育柱型苹果新品种具有重要意义。  通过精细做图已经将Co基因定位在基因组的第10条染色体上,克隆得到了部分柱型相关基因,但是柱型Co基因及其如何调控柱型形成机理仍不清楚。本文以‘Wijcik’嫩茎为材料,克隆得到柱型候选基因,命名为MdCoL,采用Real-time PCR技术检测MdCoL基因在4组柱型苹果材料(21-C、30-C、77-C、Wi)和普通型苹果(21-S、30-S、77-S、Mc)中不同时期芽的相对表达量;通过转化‘本生’烟草,验证MdCoL基因的功能;以4组柱型苹果突变体为试材,对其叶片解剖结构及光合特性的相关参数进行了观察和测定,以比较柱型苹果和普通型苹果的差别。研究结果如下:  1、以‘Wijcik’嫩茎为材料,克隆得到柱型候选基因,命名为 MdCoL,开放阅读框长度为1032bp,推测的蛋白质的分子量为38.34kD,编码339个氨基酸,等电点(pI)为6.27。对柱型苹果MdCoL蛋白进行二级结构在线预测,MdCoL蛋白包含111个α-螺旋,占32.74%;135个无规则卷曲,占39.82%;73个延伸链,占21.53%。经过氨基酸亲水性分析表明,该蛋白的多数氨基酸为亲水性氨基酸。  2、利用Real-time PCR分析了MdCoL基因在4组柱型苹果及普通型苹果的不同器官及不同发育时期的相对表达量,结果表明:MdCoL基因在柱型苹果中的芽和新梢中的表达量都明显高于普通型苹果中的表达量,且在新梢中的表达量都明显低于在芽的表达量,此外,除30-C和30-S外,MdCoL在5月份芽的表达量高于另外两个时期的芽。  3、将构建好的pCAMBIA1300-MdCoL表达载体和pCAMBIA1300空载体利用农杆菌介导的叶盘转化法分别转入‘本生’烟草,经PCR检测,获得17株阳性鉴定的烟草植株。利用洋葱表皮,瞬时表达 pCAMBIA1300-MdCoL,观察到 MdCoL基因定位于细胞膜和细胞核上。  4、以未转基因烟草为对照,对转基因烟草进行株高、节间、茎粗度、开花数、分枝数、叶绿素等生理指标测定及表型观察。结果表明:未转基因烟草在株高、节间上是转基因烟草的2-3倍,差异显著;转基因烟草根系粗壮、较长且分支多,植株叶片浓绿且厚,节间短小,植株整体表现矮小、紧凑;未转基因烟草根系短且分支少,叶片薄,节间长,植株整体表现细长;转基因烟草在花的数量上和叶绿素(SPAD)浓度是明显高于对照烟草,对照组烟草分枝数略多于转基因烟草。转基因烟草与柱型苹果“树体矮生,长分枝少,节间短”的特性表现一致。  5、对转基因烟草的赤霉素生物合成途径、受体和DELLA蛋白相关基因的表达分析,结果表明:MdCoL基因上调了DELLA蛋白相关基因,从而抑制赤霉素反应。  6、以四组柱型苹果突变体为试材,对其叶片解剖结构及光合特性的相关参数进行了观察和测定,结果表明:四组材料中,每组的柱型苹果叶片颜色浓绿,叶片较大、其重量、厚度、叶绿素(SPAD)含量、栅栏组织厚度和栅海比均显著大于普通型苹果。普通型苹果叶片中每层栅栏组织细胞大小一致,且排列整齐紧密,而柱型苹果栅栏组织细胞排列相对杂乱。在一天的光合日变化中,柱型和普通型苹果的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)均高于普通型苹果,二者均呈明显的双峰曲线,12:00出现明显的光合午休现象。在固定 LED光源下,同组材料中柱型苹果净光合速率(Pn)高于普通型,分别是普通型的1.1-1.3倍。柱型苹果荧光参数值(Fv/Fm)均低于普通型苹果,表明柱型苹果在转化光合产物过程中以荧光形式散失的能量少,有助于光合产物的积累,利于早果和丰产。
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