目的骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)具有易于获取,高度的自我更新能力,体外能大量扩增,可跨胚层分化为三个胚层来源的细胞等特点,因而被广泛应用于组织工程、再生医学及临床多种疾病的细胞移植治疗。BMSCs在体外能被诱导分化为上皮细胞,将体外培养的BMSCs移植到碱烧伤的兔角膜表面后,发现BMSCs能向角膜基质迁移并向角膜上皮细胞分化,表明体内局部微环境也可诱导BMSCs分化成与微环境功能相适应的细胞,但其机理尚不十分清楚。课题组已有实验表明胎儿肠壁结缔组织能在体外诱导BMSCs分化为上皮细胞,本实验拟比较羊膜、胎儿肠系膜及肠粘膜下层的结缔组织在体外诱导BMSCs分化为上皮细胞的作用差异,从而为进一步研究局部微环境诱导BMSCs分化的机制及其在组织工程中的应用,提供理论基础和实验依据。第一部分1收集4~5个月引产胎儿的骨髓细胞,以全骨髓直接贴壁法和密度离心贴壁法分离、培养、扩增BMSCs,比较两种方法获取BMSCs的数量。流式细胞仪检测P3 BMSCs的表型。结果显示:全骨髓直接贴壁法分离扩增出的细胞数多于密度离心贴壁法,P<0.01;P3BMSCs为均一的长梭形,呈典型的漩涡状生长。流式细胞仪检测两种方法获取的P3细胞均表达CD29和CD71,不表达CD34及HLA-DR,均一性达80.73±0.17%;两组细胞表达表面抗原荧光强度的差异无统计学意义,P>0.05。2实验观察了不同浓度DAPI对P3 BMSCs的标记,并比较了其与冻存复苏P3 BMSCs的DAPI标记率。结果见4种浓度DAPI标记BMSCs 2h后的标记率均为100%,虽然高浓度组的蓝色荧光较低浓度组明亮,但均随时间延长逐渐减弱。统计显示:40μg/ml组的阳性率高于25、5μg/ml组,P<0.01,且与50μg/ml组间的差异无统计学意义;各组标记浓度与时间的标记率间有明显的交互作用,即随时间增加4种浓度的荧光标记率均递减。40μg/ml DAPI标记冻存复苏后的P3 BMSCs的标记率与非冻存细胞相近。3不同浓度的EGF、IGF-1体外诱导P3 BMSCs培养7d后,多数细胞为梭形,少数细胞呈宽大扁平的上皮样细胞。诱导培养7d后细胞表达CK和EMA的阳性细胞率统计显示:①单用EGF 30 ng/ml或IGF-1 50 ng/ml诱导组的CK和EMA阳性细胞率高于其余浓度组,P<0.05;其中100 ng/mlEGF或IGF-1组仅少数细胞EMA阳性,CK均为阴性。②EGF和IGF-1联合诱导各组的CK和EMA阳性细胞率均高于各单用EGF或IGF-1组,P<0.01;30 ng/ml EGF和50 ng/ml IGF-1联合组的CK阳性细胞率高于其余联合诱导组,P<0.01;但联合诱导各组间的EMA阳性细胞率差异无统计学意义。③空白对照组的CK和EMA均为阴性。第二部分1取15例羊膜和20例4~5个月引产胎儿的肠壁、肠系膜。用机械分离和酶消化的方法除去上皮,制成羊膜、肠系膜和肠粘膜下层的结缔组织块。光镜观察见制备的三种结缔组织表面无上皮细胞。2将50μl (4.0×106个/ml)DAPI标记的P3 BMSCs分别种植于三种结缔组织上诱导培养,另设同时加EGF和IGF-1的对照组,以及细胞爬片对照组。液面下培养7d后,升至液-气平面培养。各组诱导培养8～12d后,冰冻切片的三种结缔组织表面均可见蓝色荧光标记的细胞;同一切片HE染色后,可见结缔组织表面有与荧光标记细胞分布一致的体积较大、核明显的细胞。免疫组化染色见三种结缔组织表面的部分细胞有CK及EMA表达。未培养的三种结缔组织中均表达EGF;肠系膜及肠粘膜下层结缔组织同时还表达IGF-1,但羊膜中IGF-1为阴性。3各组诱导培养12d后的冰冻切片和铺片经免疫荧光染色后:①CLSM下见三种结缔组织上均有胞核为蓝色荧光标记的细胞,部分蓝色荧光标记核的细胞质中有CK的红色荧光;仅羊膜上部分蓝色荧光标记核的细胞有微弱的EMA绿色荧光表达。②CLSM下随机选取铺片上5个非重叠视野,分别计数有红蓝双色荧光标记及单一蓝色荧光标记的细胞,计算出CK阳性细胞率。统计结果显示:三种结缔组织与生长因子联合诱导三个组的CK荧光阳性细胞率均高于单用三种结缔组织及单用生长因子诱导的细胞爬片组,P<0.05;三个联合诱导组间的差异无统计学意义,P>0.05;单用羊膜诱导组CK荧光阳性细胞率高于单用肠系膜及肠粘膜下层诱导组,P<0.05。4 SEM下见三种结缔组织上生长的BMSCs呈梭形,细胞表面有短而粗的微绒毛状突起。TEM下见组织上种植的BMSCs的核较大,椭圆形,核质比大,常染色质多,核糖体、线粒体等丰富;BMSCs与结缔组织间未见基膜形成。全文结论1全骨髓直接贴壁法分离扩增获取的BMSCs数多于密度离心贴壁法。2 DAPI标记BMSCs最佳终浓度是40ug/ml标记2h。3 EGF和IGF-1在体外均有诱导BMSCs向上皮细胞分化的作用;两者有协同作用,以30 ng/mlEGF和50 ng/ml IGF-1联合的协同作用最强。4肠粘膜下层、肠系膜和羊膜的结缔组织均能诱导BMSCs向上皮细胞分化,羊膜单独诱导作用最强;三种结缔组织中均有EGF表达,IGF-1仅表达于肠系膜及肠粘膜下层结缔组织,提示结缔组织中的生长因子可能是其诱导BMSCs向上皮细胞分化的内源性因素。5外源性EGF和IGF-1有协同三种结缔组织诱导BMSCs向上皮细胞分化的作用。6电镜下在BMSCs与结缔组织之间未见基膜形成。