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猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的病毒性疾病,其主要症状为呕吐、脱水、腹泻及小肠绒毛萎缩,仔猪及育肥猪均易感,其中仔猪的感染率及死亡率最高,可达80%-100%,为我国养猪业造成很大的经济损失。PEDV临床毒株分离率较低,本研究利用反向遗传技术及构建PEDV功能性受体pAPN稳定细胞系,为PEDV毒株的分离及病毒感染机制的研究奠定了基础。PEDV基因组约为28 kb,为单股正链、有囊膜的RNA病毒。本研究通过对临床流行株PEDV-CHZ进行全基因组测序分析,结合载体pBeloBAC11序列筛选到5个合适的酶切位点,拟将病毒基因组分成四段逐个插入中间质粒,从而获得包含病毒全长的cDNA感染性克隆。本研究采用融合PCR及酶切连接的方法成功构建了含有CMV启动子、PEDV-5’-3’部分片段、多克隆位点以及HDV、BGH等元件的pBAC-PEDV-5’-3’中间质粒,并分段扩增获得了 PEDV-CHZ株的四段病毒基因序列。为后续利用细菌人工染色体技术构建PEDV感染性克隆奠定一定基础。猪氨基肽酶(pAPN)是一个150 kDa的II型跨膜糖蛋白,为当前公认的猪流行性腹泻病毒感染相关功能性受体。本试验通过提取猪小肠组织总RNA,经RT-PCR扩增获得pAPN全基因序列,并将其克隆到pIRES2-EGFP真核表达载体中,从而成功构建重组表达质粒pIRES2-EGFP-pAPN从筛选细胞基因组靶向序列,通过融合PCR及同源重组技术插入重组质粒中,构建包含靶向序列的重组质粒pIRES2-EGFP-pAPN-R。pIRES2-EGFP-pAPN-R与 PX330 质粒共转染 ST/PK 细胞,经 G418 筛选、绿色荧光筛选及有限稀释法获得三株阳性单细胞克隆株分别命名为ST-PR,PK-PR,PK-PX330。经RT-PCR、Western blot、间接免疫荧光试验等结果显示pAPN在构建的ST/PK细胞系中得到稳定转录与表达。本试验成功构建了 pAPN真核表达载体,并运用CRISPR/CAS9技术结合传统方法筛选到三株稳定表达pAPN的细胞系,为蛋白稳定表达、细胞系构建新技术及病毒受体相关研究奠定了基础。