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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种发病率极高的神经退行性疾病,并且发病人群趋于年轻化。PD的主要临床表现除了静止性震颤、运动迟缓等运动症状,还有睡眠、情感、认知障碍等非运动症状。当运动症状出现时,疾病已经发生恶化。PD的病理特征是黑质致密部（Substantia nigra pars compacta,SNpc）多巴胺（Dopamine,DA）能神经元的进行性丢失和路易小体（Lewy bodies,LBs）和路易神经突（Lewy neuritis,LNs）的形成。中脑SNpc DA能神经元投射到纹状体需要大量的轴突分支,建立数十万个突触,这些神经元要维持细胞结构和基础稳态、发挥相应功能,需要大量能量供应。能量供应正常时,神经元表现良好。当任何干扰情况出现时,DA能神经元受到的影响比其他神经元更为严重。所以,在PD中,中脑DA能神经元比其他神经元丢失更加严重。全基因组关联分析（Genome wide association study,GWAS）研究发现结肠癌缺失基因（Deleted in colorectal cancer,DCC）单核苷酸多态性与PD的多个方面之间有关联,例如发作年龄、严重程度和疾病的进展。DCC是轴突导向因子Netrin-1的受体,DCC在成人的中脑腹侧表达,并且与SNpc DA能神经元共定位。最重要的是,SNpc腹侧的DA能神经元是PD中最容易丢失的DA能神经元,也是DCC表达水平最高的中脑DA能神经元的亚群。与DCC一致,Netrin-1也在中脑DA能神经元中表达,并有研究发现PD患者中脑的Netrin-1表达水平下降。Netrin-1与DCC在神经系统中发挥重要作用,比如促进突触的发育和成熟、增强突触的可塑性和维持血脑屏障的完整性。同时DCC又是一种依赖性受体,在缺乏Netrin-1的情况下,表达DCC的细胞会触发程序性细胞死亡信号传导,从而导致细胞死亡。因此,Netrin-1与DCC可能影响着SNpc DA能神经元的功能和存活。目前Netrin-1和DCC在PD中的研究是基于PD患者的尸解结果,同时观察的是DA能神经元损伤后的改变。本研究工作拟探讨PD的经典MPTP动物模型和MPP+细胞模型中神经细胞损伤的早期与Netrin-1和DCC的变化是否有相关性,为探索PD的有效诊断和治疗提供了新思路。目的:研究Netrin-1和DCC的变化与PD早期神经损伤的相关性方法:用ELISA的方法检测H-Y分级中1-1.5级PD患者血浆中Netrin-1的含量。构建了MPTP亚急性PD小鼠模型,在最后一次给药后的第1、3、7天进行取材检测。采用免疫组化的方法,对纹状体和中脑进行TH免疫染色,检测MPTP所造成的中脑DA能神经元和纹状体DA能神经元轴突末端的丢失情况。通过免疫组织荧光方法进行TH和Netrin-1/DCC共标,检测Netrin-1和DCC在中脑的表达情况。通过蛋白印迹法（Western blot,WB）的方法,研究Netrin-1和DCC在纹状体和中脑表达水平的变化。同时,使用SH-SY5Y细胞给予MPP+刺激构建细胞损伤模型,设置不同的MPP+浓度（0、20、50、100、200、500μM）和100μM MPP+不同时间（0、6、12、24、48、72 h）,利用MTT检测了给药后细胞的活力,又通过WB的方法,检测了Netrin-1和DCC的变化。WB检测Bax、Bcl-2、Caspase 3、Cleaved Caspase 3的变化,以此断定细胞凋亡的情况。采用细胞免疫荧光,对DCC进行染色并用Hoechst 33342对细胞核进行染色,检测细胞凋亡和DCC的表达之间的关系。采用WB检测Netrin-1和DCC的下游通路FAK和p FAK,Src和p Src的变化。结果:（1）首先我们用ELISA检测了PD患者血浆中Netrin-1的含量,发现在PD早期患者的血浆Netrin-1水平下降,我们证实Netrin-1与PD相关;（2）发现中脑TH与Netrin-1/DCC共标,表明Netrin-1和DCC在中脑SNpc DA能神经元腹侧表达;（3）纹状体的TH免疫染色结果表明,随着时间延长,纹状体TH的表达逐渐减少,表明MPTP诱导纹状体的DA能神经元轴突末端逐渐丢失。WB结果显示,随着时间延长,TH的逐渐减少,MAP2表达减少,Netrin-1的表达逐渐减少,而Netrin-1的受体DCC的表达逐渐增多,并且在神经元还未明显丢失的时候,Netrin-1和DCC已有明显的变化;（4）中脑的TH免疫染色结果表明,中脑TH的表达逐渐少,DA能神经元随着时间延长逐渐丢失。中脑的WB结果显示,TH表达逐渐减少,Netrin-1的表达逐渐减少,而DCC的表达逐渐增多。说明Netrin-1和DCC与DA能神经元的丢失具有相关性;（5）在不同浓度MPP+刺激SH-SY5Y细胞后,MTT结果表明随着药物浓度的增加,细胞活力逐渐下降。WB结果显示Netrin-1的表达随细胞活力的下降而减少,DCC的表达随细胞活力的下降而增多,在细胞活力还没有显著下降时,Netrin-1和DCC就已经出现明显的变化,表明Netrin-1和DCC的变化与MPP+诱导的细胞损伤具有相关性;（6）MPP+诱导细胞Bax表达增多,Bcl-2表达减少,Cleaved Caspase3的表达增多,表明MPP+诱导细胞发生了凋亡;（7）MPP+诱导细胞Hoechst33342染色增强,呈现亮蓝色,表明细胞发生了凋亡,在凋亡细胞中我们发现DCC的荧光强度增强,同样表明DCC与细胞损伤是具有相关性的;（8）随着MPP+刺激时间的延长,细胞活力逐渐下降。WB结果显示Netrin-1的表达随细胞活力的下降而减少,DCC的表达随细胞活力的下降而增多;（9）MPP+刺激SH-SY5Y细胞后,通过WB检测FAK和Src,p FAK和p Src,p FAK和p Src表达减少,表明FAK和Src的激活减少,Netrin-1和DCC的结合减少。结论:Netrin-1及其受体DCC与PD神经损伤具有相关性。且在神经损伤还不明显之前,Netrin-1和DCC就已经发生变化,但是PD中Netrin-1的减少和DCC增多的原因,以及Netrin-1和DCC的变化是否是DA能神经元变性的始发事件还尚不清楚。探究Netrin-1和DCC信号在PD中的病理生理作用可能会为疾病的治疗和诊断提供新的思路。创新性:本研究从早期PD患者、MPTP亚急性小鼠模型、MPP+细胞模型证明Netrin-1及其受体DCC与PD早期神经损伤具有相关性,为PD的早期诊断和治疗提供了新靶点。