红霉素(erythromycin，Er)是由革兰氏阳性细菌糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)合成的次生代谢产物,为一类大环内酯类抗生素,包括红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)、红霉素C(ErC)、红霉素D(ErD)等,它们结构相似,而且均有抑菌活性,其中ErA在临床上具有广泛的用途,其抑菌活性最高,而且毒性也最小。　　在糖多孢红霉菌中,负责红霉素生物合成的基因均以单一拷贝、成簇形式存在于环形染色体上,质粒不参与红霉素的生物合成。糖多孢红霉菌红霉素3"-O-甲基转移酶(EryG)是一种S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖性甲基化酶,在ErA生物合成过程中对中间产物ErC和ErD进行甲基化修饰,从而在提高红霉素的活性和降低红霉素的毒性方面起着重要的作用。　　为研究糖多孢红霉菌红霉素EryG的相关酶学性质提供一个体内研究系统,构建了糖多孢红霉菌红霉素 EryG编码基因 eryG失活的突变体 A226G-,在A226G-突变体中eryG基因已彻底失活,其编码产物EryG不再具有甲基转移酶活性。　　以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模版,用重叠PCR方法扩增出去除红霉素EryG SAM结合位点DNA序列在内290bp的约1600bp DNA片段,克隆到同源重组质粒pWHM3中,构建了pWHMΔeryG。PEG介导原生质体转化法将pWHMΔeryG质粒转入糖多孢红霉菌A226中,通过染色体同源重组整合到eryG基因位点上,用PCR方法筛选出糖多孢红霉菌整合体A226::pWHM△eryGⅠ和Ⅱ。薄层层析(TLC)和质谱(MS)结果表明在A226::pWHM△eryGⅠ中质粒pWHMΔeryG整合在eryG基因删除位点的上游,而在A226::pWHM△eryGⅡ中质粒 pWHMΔeryG整合在eryG基因删除位点的下游。糖多孢红霉菌整合体A226::pWHM△eryGⅠ在无抗R3M斜面培养基上连续生长三代后,制备原生质体涂无抗R3M平板,用TLC、PCR和MS方法筛选出一株糖多孢红霉菌红霉素eryG基因失活的突变体A226G-,此eryG基因突变体仅能生产中间产物ErC而不再合成末端产物ErA,从而说明A226G-突变体中eryG基因已彻底失活,其编码产物EryG不再具有甲基转移酶活性。　　为克隆、表达糖多孢红霉菌红霉素eryG基因,以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板,PCR扩增出eryG基因序列,克隆到原核表达载体pET-22b(+)上,构建了pETG。诱导表达结果发现糖多孢红霉菌红霉素eryG基因可以在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达,随后,将红霉素eryG基因亚克隆至糖多孢红霉菌染色体整合型表达载体pZMW上,构建了pZMWG。PEG介导原生质体转化法将pZMWG转入糖多孢红霉菌A226G-突变体中,用PCR方法筛选出糖多孢红霉菌基因工程菌株A226G-G+。TLC结果发现通过eryG基因的功能补偿,糖多孢红霉菌突变体A226G-恢复了ErA的合成能力,但产量比出发菌株A226要低。　　具有抗寄生虫、病毒和细菌活性的巨大霉素(megalomicin)和ErA有着共同的生物合成中间产物ErC,所以本研究成功构建的糖多孢红霉菌A226G-突变体以及克隆的糖多孢红霉菌红霉素eryG基因,不但为进一步深入研究EryG的相关酶学性质奠定了基础,而且也为巨大霉素生物合成ErC相关的修饰酶类提供了一个体内研究系统。