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禾谷镰孢菌是属于子囊菌门的丝状真菌,有性态为玉蜀黍赤霉,是小麦和大麦穗腐病的主要致病真菌。全世界范围内,每年能导致上亿美元的经济损失。被禾谷镰孢菌感染的谷物种子缩小且含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等毒素。其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇因能够抑制蛋白质的合成而对人畜的健康产生威胁。尽管致力于寻找植物中针对禾谷镰孢菌的抗性基因,但是到目前为止,还没有培育出有效的抗性品种。了解禾谷镰孢菌在宿主体内的侵染过程和致病机理,将有助于寻找到新的抗赤霉病的靶位点。 使用荧光蛋白AmCyan标记的禾谷镰孢菌侵染小麦胚芽鞘,并跟踪观察侵染过程。禾谷镰孢菌在宿主体内的生长过程伴随着明显的形态变化:感染12小时,孢子萌发;16小时,菌丝细小(~4μm),顶端少有分支;40小时,菌丝变粗(~6μm),顶端出现大量分支;64小时,菌丝呈现不规则状;240小时,菌丝侵占小麦胚芽鞘,并有孢子产生。因此选择16、40和64小时作为禾谷镰孢菌侵染小麦胚芽鞘的三个代表性时期,运用激光显微切割技术和芯片杂交,获得这三个时期的全基因组表达谱。 通过与培养基上生长的禾谷镰孢菌表达谱进行比较,发现344个在宿主体内优先表达的基因。约有41%的基因编码分泌蛋白。其中编码植物细胞壁降解酶的基因在64小时显著上调表达,编码活性氧产生相关的蛋白、毒素蛋白的基因在64小时开始高表达。通过分析染色体上相邻位置基因表达的相关系数,发现新的可能编码次生代谢产物的基因簇FG354,其所包含的8个基因在64小时特异性高表达。此外还发现禾谷镰孢菌在侵染过程中,糖酵解途径显著下调,而乙醛酸循环相关基因在16小时显著上调表达。 选择性地进行单个基因的敲除,并对其致病力进行检测。选择编码植物细胞降解酶的基因CbhC1(纤维二糖水解酶,降解纤维素)和Eng1(β-1,3(4)-葡聚糖内切酶,降解半纤维素)、编码细胞表面蛋白的基因CFEM1、FG3_54基因簇中的3个基因(NPS9,FGSG_10992和FGSG_10995)和编码线粒体内膜上负责乙醛酸循环和三羧酸循环产物转运的基因CIC1,进行单个基因突变。突变体均呈现显著的致病缺陷。此外对编码KP4-like蛋白的3个基因进行RNA干扰,突变体侵染仅限于小麦胚芽鞘的伤口处。这些都验证芯片结果的可靠性,同时也在一定程度上为致病因子的筛选提供借鉴。 上述7个在小麦胚芽鞘上致病力显著下降的基因敲除突变体,有4个(△cfem1,△FGSG_10992,△FGSG_10995和△cic1)对小麦穗部的致病力也显著下降,而其余3个基因突变体致病力没有变化,预示着这3个基因是侵染小麦胚芽鞘而非穗部的致病因子。同时我们还获得禾谷镰孢菌侵染小麦穗部4个时期的表达谱,为全面阐述组织特异性的侵染策略提供基础。 总之,利用基因敲除和快速致病力检测的方法验证了部分基因的功能,发现新的可能编码次生代谢产物且与致病力相关的基因簇FG354,而且第一次发现并验证乙醛酸循环在禾谷镰孢菌侵染宿主时的作用。最终根据基因表达和侵染过程中真菌形态的变化,揭示禾谷镰孢菌从前期隐蔽侵入到后期彻底破坏宿主细胞的侵染策略。