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新的致癌基因CSF3R突变对慢性中性粒细胞白血病影响的研究本文主要研究一个新发现的基因——粒细胞集落刺激因子受体(CSF3R),它的突变尤其是突变位点CSF3R-T618I,以及我们首次报道的突变位点CSF3R-H54A对慢性中性粒细胞白血病的分子发病机理的影响。第一部分.病例报告慢性中性粒细胞白血病伴EVI-1基因高表达和CSF3R、SETBP1基因突变背景：慢性中性粒细胞白血病(CNL)是一种罕见的骨髓增殖性肿瘤(MPN),表现为持续的中性粒细胞增多,脾肿大,骨髓粒系增生而不伴有明显的发育异常,费城(Ph)染色体阴性。我们的病例特点是伴有显著和持续的中性粒细胞增多,NAP积分值增高,Ph染色体及BCR-ABL融合基因阴性,并排除导致类白血病反应的潜在疾病。在我们的病例中,初次接诊病人并无肝脾肿大,但其他的实验室检查结果满足WHO诊断标准。一年后患者由于疾病进展,出现牙龈出血,脾肿大,淋巴结肿大。该患者在临床治疗过程中外周血细胞计数的平均值如下：白细胞28.36×109/L(范围7.67-51.28 X109/L),成熟中性粒细胞占88.5%(范围78.8-98.5%),血小板33.3×109/L(范围23-94×109/L)。在治疗的过程中,患者出现了血小板减少症,并逐渐对羟基脲和IFN-a治疗反应不佳。材料/方法：收集该CNL患者的外周血,利用Ficoll梯度密度分离方法获取外周血单个核细胞(PMNCs),并将其置于完全培养基,37℃,5%CO2的温箱中培养。利用LSR Ⅱ流式细胞仪检测中性粒细胞的功能,如细胞凋亡,细胞周期和细胞迁移能力。将中性粒细胞置于含10%FBS的RPMI 1640培养基中培养,在不同时间点,收集细胞并用Annexin V和PI (BD Pharmingen公司)标记,检测细胞凋亡与正常对照组的差异。将纯化的中性粒细胞培养在transwell小室(1×106/孔),并且将趋化肽N-甲酰基甲硫氨酰亮氨酰苯丙氨酰(fMLP, 1uM, SIGMA)加入到下室中。在每个时间点,我们计数下室的中性粒细胞数量,检测中性粒细胞的迁移能力。通过FACSAria Ⅲ(BD Biosciences公司)流式细胞仪分别分选CD34+和CD15+的细胞,利用基于PCR的DNA焦磷酸测序方法检测致癌基因CSF3R整个外显子和内含子的突变情况。结果：该病人的成熟中性粒细胞占93.9%。利用流式细胞仪检测细胞凋亡的结果显示,该患者的中性粒细胞96h后仍然存活,而正常对照组中的中性粒细胞在72h后仅少量存活。细胞周期结果显示正常,提示所有的细胞都发生终末分化,而没有细胞分裂。实验组中性粒细胞对由fMLP诱导的的迁移活性明显低于正常对照细胞,但比正常阴性对照更高(不含fMLP)。有趣的是,我们通过定性检测方法观察到EVI-1基因阳性。我们还分选了CD 34+、CD 15+的细胞以及骨髓细胞,3次通过荧光定量RT-PCR方法检测EVI-1基因的表达水平。我们发现,这些定量结果相似,尤其是骨髓细胞和CD 34+细胞EVI-1基因均高表达,而CD 15+的细胞EVI-1基因阳性,但其表达水平较低。该病人CD34+和CD15+的细胞的CSF3R膜近端第14个外显子存在T618I突变。此外,我们还发现CSF3R第4外显子存在H54A的杂合突变。我们还扩增了体细胞SETBP1基因,并对其第3个外显子706-917之间的密码子进行测序,评估sETBP1基因突变情况。我们的结果显示该患者体细胞SETBP1基因存在杂合突变(2602C>A),导致868位的天冬氨酸突变为天冬酰胺。结论：该患者为67岁的老年男性,表现为持续的中性粒细胞增多和血小板减少,不存在BCR-ABL 1融合基因和JAK2基因V617F突变,伴EVI-1基因过度表达和CSF3R和SETBP1并发突变。我们首次发现CSF3R-H54A突变位点,并最终诊断为CNL。我们接下来的研究将进一步阐释突变位点对CNL的分子发病机理的影响。第二部分CSF3R基因突变位点对CNL克隆优势的作用研究目的：检测CSF3R-FL、CSF3R-T618I和CSF3R-H54A突变对CNL的分子发病机制的影响材料/方法：1.质粒构建：使用标准的分子生物学方法扩增插入物,限制性酶切和连接构建质粒。过程概括如下：宿主载体pLV-EF1α-EYFP-N,pLP-2,pVSV-G, pLP-1利用试剂盒(Omegabio-tek maxi prep kit)纯化,并通过限制性内切酶(ECO RI,NOTI)酶切。利用DNA提取试剂盒(AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit)对琼脂糖凝胶中的线性化的载体进行纯化,样品浓度的估测参照溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上的DNA Maker.所有插入物(CSF3R-FL,CSF3R-T618L,CSF3R-H54A)通过PCR扩增获得。扩增的DNA片段使用DNA提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收纯化,并通过ECORI, NOTI酶切使载体线性化。酶切反应如下：i)插入体系(反应总体积40μl)： 100-3000ng纯化的PCR产物,适量的消化酶,10×反应缓冲液4 μl,置于适当的温度过夜反应；ii)载体体系(反应总体积20μl)：2000-4000ng质粒DNA,适量的消化酶,10×反应缓冲液2μl,适当的温度下反应4小时。必要时将酶切的片段再次纯化,插入物的浓度评估方法同上。将载体：插入物按1：3的摩尔比加入体系用于连接反应。将连接反应的产物转化到化学感受态细胞DH5 α大肠杆菌,并置于含氨苄青霉素(Sigma公司)的LB琼脂平板上生长。一天后挑取单菌落,接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基过夜培养。质粒从上述过夜培养物中纯化,并通过限制性图谱测试插入体的存在与否。所选克隆用Sanger方法测序。2.慢病毒包装：我们的系统包括了3种主要成分,如慢病毒表达载体(CSF3R-FL和CSF3R-T618I质粒DNA),慢病毒包装质粒(pLP-1,pLP-2, pVSV-G),293TN细胞。我们将1×105个293TN细胞接种到10cm2培养皿中,加入2-3ml含4mML-谷氨酰胺、4.5g/l葡萄糖和10%胎牛血清的DMEM培养液,置于37℃5%CO2的温箱中培养18-24h。当细胞汇合率达到60%～80%时用于转染。我们利用绿色荧光蛋白(GFP)作为阳性对照,来证实转染成功与否。再收集含感染性假病毒颗粒的培养基上清液。3.将假病毒颗粒转导到小鼠骨髓原始细胞：我们利用MethoCultTM培养基进行小鼠骨髓细胞集落培养,用于评估CNL相关的致癌基因对小鼠骨髓原始细胞的形态和数量的影响。其中,我们设立了不含病毒转导和不表达目的基因转导的对照组(CSF3R-FL, CSF3R-T618I)。结果：1、我们成功提取和纯化了含CSF3R-FL和CSF3R-T618I重组质粒的克隆,但未获得CSF3R-H54A重组质粒的克隆。2、转染293TN细胞24h后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白。3、CSF3R两种克隆均能转导到小鼠集落形成细胞,于接种7天后显微镜下计数CFU-GM克隆,其中膜近端突变T6181转导的粒单-集落形成单位(CFU-GM)计数多于全长非突变株(CSF3R-FL),提示CSF3R-T618I突变有利于CNL白血病细胞的克隆。结论：1、质粒构建、病毒包装和小鼠骨髓细胞集落形成实验均顺利完成。2、我们证实了CSF3R突变的转导能力,并发现CSF3R-T618I转导能力强于CSF3R-FL。该结果表明CSF3R-T618I突变有利于CNL白血病细胞的克隆。3、我们后期实验将进一步研究新发突变CSF3R-H54A对小鼠骨髓原始细胞集落形成的影响。