基因修饰脐带间充质干细胞hUC-MSCs-pIGF-1在脑损伤修复中的功能研究

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研究背景脑损伤是指来源于外来因素对头部所造成的严重创伤,其预后常常较差,死亡率在4%-7%之间,重度脑损伤的死亡率高达50%-60%。常见的脑损伤包括新生儿缺血缺氧性脑损伤(Neonatal hypoxic ischemic brain damage,NHIBD)、高原缺氧缺血脑损伤(Plateau hypoxic ischemic brain damage,PHIBD)、放射性脑损伤(Radiation brain injury,RBI)等。新生儿缺血缺氧性脑损伤是导致新生儿死亡的主要原因,常常可以引起慢性神经系统损伤。该病病死率高,病情重,致残率高。随着生命维持技术和新生儿抢救水平的提高,重度窒息儿、早产儿和各种脑部损伤的新生儿存活率大大提高,这使得NHIBD的患病率不仅没有减少,反而有升高的趋势,目前已成为新生儿残疾的主要原因,对新生儿身心发育和生活质量造成了恶劣的影响。高原缺氧缺血脑损伤是一种高原特发病,常常发生在高海拔地区。因其起病急、并发症多、病情重、处理不及时、发病快、病死率极高,因此是一种严重威胁急进高原人群生命安全的危重病。随着高原地区的开发建设,急进高原的人数急剧增加,高原脑水肿的发病人数和死亡人数越来越多,不仅制约了高原地区的发展和建设,也严重影响高原居民的健康和生命安全。放射性脑损伤是指放射性疗法在治疗脑部疾病或者人体接触高剂量射线辐射时所产生的副作用,可引起急性和慢性毒性,使有诸如疲劳、头痛、呕吐、腹泻等不良反应,并会伴有免疫功能退化、白细胞数量下降等并发症,导致一些患者不得不放弃治疗。现在对于放射性脑损伤的发生机制还不是很清楚,所以缺少有效的治疗方法和治疗药物。神经细胞和星形胶质细胞被证实在哺乳动物大脑中可以发挥自我更新的功能,因此神经生物学的研究成为中枢神经系统损伤的研究热点,其中细胞替代疗法已经成为商业活动和研究机构所关注的一大焦点。越来越多的证据表明,通过移植干细胞治疗受损部位可能是治疗脑损伤后功能障碍的最有希望的治疗方案之一。当疾病或创伤所引起的神经功能缺失可以通过引入新的细胞来替代丧失的神经元和胶质细胞,或者引入的细胞可以通过神经营养作用来增加受损神经细胞的可塑性以及存活率来发挥作用,也即所谓的替代疗法。现在各种类型的干细胞,如神经干细胞,胚胎干细胞和间充质干细胞已经被用于移植研究,并进行相应的中枢神经系统损伤治疗。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)由于存在明显道德伦理障碍和胎儿组织来源不足等问题,尽管移植后对脑损伤的大鼠功能恢复有治疗作用,但是因为其在体内容易成瘤限制了其在人体当中的应用。最新的研究结果表明诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)与ESC一样,具有全能性,但是它同样存在体内形成肿瘤的危险。神经干细胞(Neural stem cells,NSC)是一种用来移植治疗脑损伤的理想细胞,它既可以分泌多种神经营养因子又可以分化成神经细胞,但是大量神经干细胞的来源问题仍然限制了它的应用。人间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)被认为是良好的脑损伤移植治疗的备选细胞。在临床研究和实验中骨髓间充质干细胞(bone mairow mesenchymal stem cells,BM-MSC)是目前使用较为广泛的种子细胞。但抽取骨髓是一个具有高度侵入性的过程中,并且有损伤存在感染的风险,而且其扩增能力和分化的潜能都会随着年龄的增加而降低,因此寻找BM-MSC的替代细胞已经成为一个研究热点。人脐带间充质干细胞(Umbilical cord Mesnchymal Stem Cells,UC-MSCs)的发现给脑损伤患者带来了新的希望。UC-MSCs具有多向分化的潜力。在一定条件诱导下,可分化成脂肪细胞、心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等,是理想的组织工程种子细胞,具有很强的定向分化和增殖能力。与其他类型干细胞相比较,脐带间充质干细胞具有以下优点:更原始的干细胞,更强的增殖分化能力;免疫原性弱;干细胞易于分离;安全性较高。目前脐带间充质干细胞已成为国内外研究的热点。对于MSCs的应用研究主要集中在以下两个方面:一是通过体外分离培养并大量扩增MSCs并将其直接移植到神经系统病变部位,从而起到修复作用;二是将MSCs作为载体,将有治疗作用的特定基因克隆到MSCs而制作基因修饰间充质干细胞,通过移植达到基因治疗和细胞替代的双重功效。研究表明胰岛素样生长因子-l(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)是一种多肽类激素,由70个氨基酸组成的单链碱性多肽分子,分子量为7649。它来源于体内许多细胞,通过自分泌、旁分泌和内分泌等多种机制与IGF-1受体(IGF-1R)结合从而发挥多种功能。最近研究发现,IGF-1不仅对大脑发育、生长、髓鞘的形成有重要的作用,还能够在体外诱导血管和神经内皮细胞的分化、增殖及调节细胞活性,对许多中枢疾病发挥着保护作用,因此越来越得到广大国内外学者的关注。基因修饰MSCs治疗作为基因介入治疗方法的一种,它可以通过基因修饰的方法使间充质干细胞表达外源性基因,然后将其移植到受损部位分泌大量治疗性神经营养因子,以防止神经元死亡并促进神经再生与功能恢复的一种治疗方法。本文选择IGF-1对MSCs进行基因修饰构造基因工程脐带间充质干细胞,通过细胞移植探讨对脑损伤修复的作用及其机制的研究尚无报道。本课题旨在寻求新的MSCs来源,构造基因工程修饰脐带间充质干细胞hUC-MSCs-pIGF-1,通过对移植hUC-MSCs-pIGF-1的NHIBD、PHIBD、RBI大鼠模型以及RBI西藏小型猪模型进行效果评估,探讨基因修饰脐带间充质干细胞hUC-MSCs-pIGF-1对脑损伤修复的作用,从而为临床应用hUC-MSCs-pIGF-1治疗脑损伤奠定理论基础。研究目的1、对西藏小型猪IGF-1基因进行系统的研究,为下一步基于西藏小型猪IGF-1基因的研究提供分子基础和实验依据。2、研究人脐带来源的间充质干细胞体外培养及鉴定的方法,观察脐带间充质干细胞传代、分化和增殖的规律,建立合适的体外稳定培养体系。3、化学合成法构建质粒pIRES2-EGFP-IGF-1并通过慢病毒转染MSCs以建立基因修饰后的hUC-MSCs-pIGF-1干细胞系,为脑损伤修复的治疗打下基础。4、构建SD大鼠新生儿缺血缺氧模型、高原缺氧缺血模型、放射脑损伤模型以及西藏小型猪放射脑损伤疾病动物模型。5、探讨基因修饰脐带间充质干细胞hUC-MSCs-pIGF-1在脑损伤修复中的功能,为临床应用基因修饰干细胞移植治疗脑损伤提供理论支持。研究方法1、采用PCR-SSCP和PCR产物测序的方法进行西藏IGF-1基因的分型及SNP位点的寻找。同时对西藏小型猪IGF-1基因进行克隆测序分析,通过实时荧光定量PCR对不同年龄段西藏小型猪IGF-1基因在脑内的相对表达量进行测定分析。2、人脐带间充质干细胞的分离及鉴定:购自广东省脐带血造血干细胞库的MSCs细胞,以1 × 106/ml密度接种到培养瓶中,加入含有B27、EGF和bFGF的无血清DMEM/F12培养基,37℃、5%条件下培养细胞,3天后半量换液。待细胞培养至第7天,离心收集间充质干细胞,使用胰蛋白酶消化法和机械法相结合的方法进行传代,以5×105/ml将传代后的间充质干细胞接种于新培养瓶,置37℃、5%条件下继续培养。倒置显微镜动态观察细胞生长情况。采用流式细胞仪对脐带间充干细胞 CD90 FITC,CD105 PE,CD73 PE,CD45 FITC,CD34进行表面抗原检测。3、通过基因合成的方法合成质粒pIRES2-EGFP-IGF-1,并进行测序鉴定。通过慢病毒转染脐带间充质干细胞,建立基因修饰间充质干细胞hUC-MSCs-pIGF-1,利用体外RT-PCR的方法检测IGF-1的表达。4、新生SD大鼠缺血缺氧脑病模型的制备及治疗效果评价:通过结扎单侧颈动脉构建新生SD大鼠缺血缺氧脑病模型,模型构建成功后在脑立体定位仪引导下向左侧侧脑室注射MSCs。7d龄SPF级SD大鼠85只,其中取20只为正常对照组65只进行HIBD动物模型制作。将造模后存活的60只大鼠随机分成模型对照组,MSCs移植组和MSCs-IGF-1移植组,每组20只,每一组再随机分成5d组,7d组,14d组,21d组,每组5只。采用行为学检测(水迷宫)的方法对所有动物进行检测;HE染色结果观察缺血区细胞形态和结构;通过Nestin免疫细胞化学染色观察间充质干细胞增殖,分化及在大鼠脑内分布情况;Brdu荧光标记法观察侧脑室阳性细胞的表达情况;统计相关区域阳性细胞数。5、SD大鼠高原脑损伤模型的制备及治疗效果评价:48只10d龄SD大鼠,采用完全随机方法分成对照组(8只)、2000 m海拔高原组(8只)、4000 m海拔高原组(8只)、6000m海拔高原组(24只),其中6000m高原组又分为实验组、MSCs移植组和MSCs+IGF-1移植组,每组8只。实验组大鼠置于高原低压环境模拟仓结合运动的方法制作新生儿高原脑缺氧缺血模型,运动方式为在舱内游泳槽进行60 min/d的游泳运动,且在高原低压环境模拟仓内生活时间每天不得少于20小时。每组大鼠分别在第3、7、11、15d用Zea Longa 5分制评分标准进行行为学评分并且于第15d采集静脉血,在扫描电镜下观察红细胞形态。每组处死后取脑组织进行HE染色和TTC染色。TTC观察梗塞面积的变化;通过Nestin免疫细胞化学染色观察间充质干细胞增殖,分化及在大鼠脑内分布情况;Brdu荧光标记法观察侧脑室阳性细胞的表达情况;统计相关区域阳性细胞数。6、SD大鼠放射脑损伤模型的制备及治疗效果评价:54只成年雄性SD大鼠随机分为4个实验组和对照组。每组各9只,实验组腹腔注射3%戊巴比妥后分别接受2Gy、5Gy、10Gy单次全身X线照射,其中10Gy组又分为实验组、MSCs移植组和MSCs+IGF-1移植组,每组9只。并于放射后72h处死,取脑组织进行组织病理的观察。扫描电镜下观察红细胞形态。通过Nestin免疫细胞化学染色观察间充质干细胞增殖,分化及在大鼠脑内分布情况;Brdu荧光标记法观察侧脑室阳性细胞的表达情况;统计相关区域阳性细胞数。7、西藏小型猪放射脑损伤模型的制备:36只成年雄性西藏小型猪随机分为实验组和对照组。对照组9只,实验组27只,接受10 Gy单次X线照射。实验组的西藏小型猪又被分为3个亚组,每组9只,分别于放射后6h,24h,72h进行PET/CT扫描然后处死取脑组织进行组织病理及超微结构的观察。免疫组化法检测脑内IGF-1和IGF-1R的表达情况。研究结果:1、所测序列中西藏小型猪IGF-1存在1个突变位点T40C。将GenBank中搜索到猪的IGF-1基因的cDNA序列与西藏小型猪IGF-1基因的编码区与进行比对分析发现,在440bp、455pb处发生了 G→A、C→T的突变,该位点的突变引起了组氨酸变成精氨酸、亮氨酸转变成丝氨酸。同时研究发现IGF-1基因在0、0.1、0.25、0.5、1、2、3岁各个年龄阶段脑组织中均有表达。且IGF-1基因在0.25岁时达到峰值。2、hUC-MSC首次传代后发现细胞生长速度较原代细胞快,大约在第3d可以达到80%汇合,继续进行传代培养。当细胞传到第3代后细胞形态基本保持一致。冻存细胞后复苏成活率可达90%,复苏后细胞状态未见明显改变。细胞表面抗原检测发现hUC-MSCs表达间充质干细胞的表面抗原(CD90,CD105,CD73),不表达血液和内皮系统的表面抗原(CD34和CD45)。说明传代的MSC具有间充质干细胞的抗原特性。3、目的基因IGF-1与质粒pIRES2-EGFP连接产物pIRES2-EGFP-IGF-1经XhoI/EcoRI双酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳显示在5236bP处和579bp处各有一条亮带,结果与质粒载体及目的基因大小相符,证明所构建的载体pIRES2-EGFP大小及方向正确。同时测序发现目的基因符合genebank序列表明表达载体pIRES2-EGFP-IGF-1成功构建。pIRES2-EGFP-IGF-1质粒转染脐带间充质干细胞后48小时,荧光共聚焦拍照可见明显的GFP的细胞。实时荧光定量PCR显示转染后IGF-1的相对表达量具有显著性差异(P<0.05),表达均有上调的现象,且pIRES2-EGFP-IGF-1转染的脐带间充质干细胞的表达量更高。4、HE染色结果和水迷宫结果显示单侧结扎颈总动脉和低氧处理后可成功构建HIBD模型。MSCs-IGF-1移植HIBD动物模型后,用免疫荧光对BrdU示踪结果显示,MSCs移植组和MSCs-IGF-1移植组均可见到BrdU 阳性细胞,且移植7d后,MSCs移植组和MSCs-IGF-1移植组间进行比较,BrdU 阳性率差异显著。Nestin免疫组化方法提示MSCs-IGF-1移植组和MSCs移植组Nestin阳性细胞上升较快,移植后14d时达峰,后逐渐下降。移植7d后,各组间Nestin 阳性细胞表达量均有显著性差异。水迷宫结果显示MSCs-IGF-1移植组明显优于模型对照组。5、HE染色、神经病学评分、TTC染色及血细胞扫描电镜结果表明高原结合运动可以成功构建高原缺氧缺血脑损伤动物模型,且在6000m海拔高度脑损最为明显。MSCs-IGF-1移植高原脑损伤动物模型后在海拔6000m组MSCs移植组和MSCs-IGF-1移植组均可见到BrdU 阳性细胞。移植11d后,MSCs移植组和MSCs-IGF-1移植组间进行比较,BrdU 阳性率差异显著。移植7d后,各组间Nestin 阳性细胞表达量均有显著性差异。6、HE染色、血细胞扫描电镜结果表明当辐射剂量在5Gy时大鼠便可出现明显的临床症状,但脑部HE染色结果提示大脑部分损伤较轻,选用10Gy剂量组后大鼠脑部损伤明显,有典型的病理变化。因此选用10Gy作为构建放射脑损伤模型的标准。MSCs移植组和MSCs-IGF-1移植组均可见到BrdU阳性细胞,移植48h后,MSCs移植组和MSCs-IGF-1移植组间进行比较,BrdU 阳性率差异显著,且各组间Nestin阳性细胞表达量均有显著性差异。7、采用10Gy全身放射构建模型后,HE结果和扫面电镜结果均可见放射后72h淋巴结明显破坏,PET/CT结果显示在1OGy的辐射剂量下观察时间点因素对脑FDG摄取的影响具有显著性差异,SUV值与时间成正比。免疫组化结果显示放射性损伤后10Gy照射后,与对照组比较,西藏小型猪脑组织中IGF-1表达水平显著下调(p<0.05),而IGF-1R的表达水平与对照组比较没有统计学差异(p>0.05),该结果提示IGF-1在西藏小型猪脑损伤动物模型中有着重要作用为下一步实验开展小型猪细胞移植做铺垫。
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