犬瘟热(Canine Distemper, CD)是犬等肉食动物中的一种高度接触性、致死性传染病,是危害犬养殖业、毛皮动物养殖业及野生动物保护业最严重的疫病之一。本实验旨在建立犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA方法、制备胶体金免疫层析试纸条,适用于临床犬瘟热病毒的快速检测。实验内容包括两部分：实验一：将分泌犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D7和3H11,分别腹腔注射BALB/c小鼠,制备单克隆抗体腹水,纯化并鉴定。将单克隆抗体3H11加以辣根过氧化物酶标记,以单抗1D7作为包被抗体,以酶标抗体3H11作为检测抗体,建立检测犬瘟热病毒的单克隆抗体夹心ELISA方法。对最佳工作条件进行了优化,最终确定：单抗1D7的包被浓度为20μg/mL,包被最佳条件为4℃过夜,最佳封闭液为5%的脱脂奶粉,酶标抗体工作浓度为1：4000。包被的犬瘟热抗体与犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒Ⅰ型(CAV-I)等无交叉反应；建立双抗夹心ELISA方法可以检测到的最低病毒含量为102TCID50/mL;板内和板间变异系数在0.5%-6.3%之间；对50份临床样品检测并与商品试剂盒比较,两者共同符合率为92%。以上试验结果表明建立的犬瘟热病毒双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性强、敏感度高、重复性好等优点。实验二：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,标记纯化的单抗3H11,制备金标抗体玻璃纤维素膜；将纯化的单抗1D7作为捕获抗体,固定于硝酸纤维素膜(NC)上,制备胶体金免疫层析检测试纸条。对最佳工作条件进行了优化,最终确定：胶体金标记抗体3H11的最佳浓度为17gg/mL,标记最佳pH值为8.0；包被于NC膜的抗体1D7浓度为2.0mg/mL。制备的胶体金免疫层析检测试纸条不与犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPⅣ)、犬腺病毒(CAV-1)等发生交叉反应；敏感性试验结果表明,试纸条可以检测到的最低病毒含量为103TCID50/mL,灵敏性稍低于双抗体夹心ELISA方法；不同批次试纸条对样品的检测结果一致；4℃和25℃条件下可以保存6个月。以上试验结果表明制备的试纸条具有较高的特异性、敏感性和稳定性,1-5min内即可得出检测结果,便于CDV的临床快速诊断与样品现场检测。