基于PAMAM介导生物素化纳米探针的LF-NMR快速检测沙门氏菌

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沙门氏菌是食源性传染病的主要病因之一,严重威胁着公众的健康。它可以在生产、加工和销售的各阶段进入食品供应链。因此,沙门氏菌的高流行率需要可靠、高效的检测方法。基于平板计数传统检测方法费时费力,迫切需要建立新型快速、准确的检测方法。磁性纳米粒子结合低场核磁共振技术是食源性致病菌快速检测的有效方法,免疫磁性纳米粒子直接捕获沙门氏菌抗体用量大,灵敏度低。本研究为了降低成本,提高灵敏度,建立了基于树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)介导的放大功能化超顺磁性纳米粒子(SPIONs)探针,并结合低场核磁共振检测牛奶中的沙门氏菌。主要研究内容如下:1、低场核磁共振生物传感器探针的制备及其表征。该生物传感器探针制备过程中需合成信号源生物素修饰的牛血清白蛋白纳米粒子(BT-BSA-SPIONS)以及信号放大物链霉亲和素修饰的树枝状聚酰胺-胺(SA-PAMAM)。通过单因素实验确定探针合成的最优工艺条件。采用粒度电位、傅里叶红外和扫描电镜(SEM)等手段对制备好的BT-BSA-SPIONs进行结构及形貌分析。结果发现,制备的BT-BSA-SPIONs修饰成功且分散性能良好。采用电位、傅里叶红外对SA-PAMAM进行表征,结果发现SA成功修饰在PAMAM表面。2、建立一种基于生物素化纳米粒子的LF-NMR快速检测沙门氏菌的方法,整个捕获操作在酶标板中进行,以双抗夹心的方式固定抗原,然后加入信号源(生物素化的纳米粒子),最终将探针捕获的抗原洗脱下来,收集洗脱液,测T2信号值。使用LF-NMR检测,2 min中内即可得到结果,整个操作过程约3 h。本研究构建的基于生物素修饰的纳米粒子的LF-NMR检测系统,在PBS和牛奶加标样中的检测限为10~5 CFU/mL,该方法相比其他方法具有良好的特异性和操作方便等特点。3、建立一种基于PAMAM介导生物素化纳米粒子探针的LF-NMR快速检测沙门氏菌。利用合成好的探针构建检测系统,使用双抗夹心方式在酶标板中固定目标菌,依次加入SA-PAMAM和功能化修饰的超顺磁性纳米粒子,然后用洗脱剂将信号物质超顺磁性纳米粒子洗脱下来。通过低场核磁共振仪测定T2信号检测目标菌。通过优化检测系统,得到最佳参数:包被抗体用量0.5μg/mL、封闭剂为2%BSA、生物素化抗体用量0.5μg/mL、SA-PAMAM用量0.75μg/mL、磁珠用量10μg、探针孵育时间30 min。在最优条件下,该低场核磁共振生物传感器在3 h内对牛奶中的沙门氏菌进行快速检测,检测限为10~4CFU/mL,此外,LF-NMR生物传感器显示出良好的特异性和抗干扰性。因此,本文建立的创新检测平台可灵敏,快速且高效地检测食源性致病菌。
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