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目的和意义微波广泛存在于人们的日常生活和工作环境之中,其健康危害备受关注。脑是微波辐射最为敏感的靶器官之一,微波辐射可引起神经元突触可塑性损伤,但其致伤机制未明。作为细胞内主要的降解途径之一,自噬参与调节突触的结构和功能,与突触可塑性密切相关。AMPK/mTOR通路对于维持细胞能量和营养稳态发挥重要作用,是调控自噬的重要通路。然而,微波辐射后神经元自噬的发生及规律尚待明确、自噬的调控机制及自噬在突触可塑性损伤中的病理生理意义尚待揭示。因此,本研究为阐明微波辐射致突触可塑性损伤的分子机制、寻找敏感指标和防治靶点奠定基础。材料与方法一、微波辐射对大鼠海马神经元自噬及AMPK/mTOR通路的影响研究二级雄性Wistar大鼠110只,随机分为假辐射组(SH组)和微波辐射组(MW组)。采用平均功率密度为30mW/cm~2微波辐射大鼠。于辐射前和辐射后即刻,采用红外热像仪和智能测温计检测大鼠体表温度和肛温的变化;于辐射后6h、7d、14d、1m、2m和3m,分别采用Morris水迷宫、多导生理仪、LTP记录仪、高效液相色谱、苏木素伊红染色和透射电镜等技术手段检测大鼠空间学习和记忆能力、脑电和海马神经元突触可塑性(LTP、神经递质和突触形态)的变化;采用透射电镜、Western Blot、免疫组织化学和图像分析技术检测海马神经元自噬形态、标志物(LC3-I/II、Beclin1和LAMP1)及自噬相关基因(Atg5、Atg7和Atg9)的变化;采用免疫荧光和图像分析技术检测大鼠海马组织LC3和突触素I的表达和分布,观察自噬体和突触囊泡的共定位变化;采用Western Blot和图像分析技术检测大鼠海马组织AMPK/mTOR通路关键分子(p-AMPKαThr172,AMPKα,p-mTOR Ser2448和mTOR)的变化。二、AMPK/mTOR对微波辐射致神经元自噬的调控作用研究采用30mW/cm~2微波辐射原代大鼠海马神经元和NGF诱导的PC12细胞,于辐射后1h、6h、12h和24h,采用扫描电镜、膜片钳和高效液相色谱检测神经元突触可塑性(突起形态、EPSC和神经递质)的变化;采用透射电镜、免疫荧光、Western Blot和图像分析技术检测PC12细胞自噬形态、LC3通量、自噬标志物(LC3-I/II、Beclin1和LAMP1)及相关基因(Atg5、Atg7和Atg9)和AMPK/mTOR通路关键分子(p-AMPKαThr172,AMPKα,p-mTOR Ser2448和mTOR)的变化;于辐射前1h,向PC12细胞培养液中分别加入AMPK抑制剂Dorsomorphin和mTOR抑制剂Rapamycin,于辐射后6h,检测PC12细胞AMPK/mTOR磷酸化和功能性自噬(LC3通量)的变化。三、自噬在微波辐射后突触可塑性损伤中的作用研究于辐射前1h,向PC12细胞培养液中分别加入自噬抑制剂LY294002和激活剂Rapamycin,于辐射后6h,检测PC12细胞功能性自噬(LC3通量)和突触可塑性相关指标(突触形态和神经递质)的变化。实验结果一、大鼠体温改变MW组大鼠体表温度和肛温于辐射前和辐射后即刻均未见明显差异(P>0.05)。二、大鼠认知功能和海马神经元突触可塑性改变1.空间学习和记忆能力:与SH组相比,MW组大鼠于辐射后7d和14d AEL明显延长(P<0.05或P<0.01);平台所在象限停留时间百分比于辐射后7d、14d和1m明显降低(P<0.05或P<0.01);穿越平台次数于辐射后14d显著减少(P<0.01)。2.脑电图:与SH组相比,MW组大鼠EEG重心频率于辐射后6h和7d明显降低(P<0.05或P<0.01);α波功率于辐射后6h明显降低(P<0.05);θ波功率于辐射后6h显著升高(P<0.01);δ波功率于辐射后6h和7d显著升高(P<0.01)。3.在体海马LTP:与SH组相比,MW组大鼠海马PS幅值在强直刺激后增加程度于辐射后6h显著降低(P<0.01),提示LTP诱导抑制。4.海马组织Glu和GABA含量:与SH组相比,MW组大鼠海马组织Glu含量于辐射后7d和14d明显降低(P<0.05);GABA含量于辐射后14d明显升高(P<0.05);Glu/GABA比值于辐射后7d和14d明显降低(P<0.05或P<0.01)。5.海马组织和超微结构:SH组大鼠海马呈正常组织结构,神经元突触结构正常;MW组部分神经元胞体缩小,胞质嗜酸性染色,核固缩深染、呈三角形或梭形;突触囊泡减少、突触间隙模糊、突触后致密物增加,上述改变见于辐射后7d、14d和1m,辐射后3m恢复。三、大鼠海马神经元自噬形态、标志物和相关基因改变1.自噬形态:与SH组相比,MW组大鼠海马神经元自噬体和自噬溶酶体于辐射后7d、14d和1m明显增多,并见自噬体包裹突触囊泡现象。2.自噬标志物和相关基因:与SH组相比,MW组大鼠海马组织LC3-II/LC3-I比值于辐射后14d和1m显著升高(P<0.01),Beclin1于辐射后7d和14d表达明显增加(P<0.05或P<0.01),LAMP1于辐射后7d、14d和1m表达显著增加(P<0.01),Atg5于辐射后7d和14d表达明显增加(P<0.05或P<0.01),Atg9于辐射后7d表达显著升高(P<0.01)。四、大鼠海马组织中自噬体和突触囊泡共定位改变与SH组相比,MW组大鼠海马组织LC3和突触素I重叠区域于辐射后14d增加,其皮尔逊相关系数显著升高(P<0.01),提示自噬体和突触囊泡共定位增加。五、大鼠海马组织AMPK/mTOR通路改变与SH组相比,MW组大鼠海马组织p-AMPKαThr172/AMPKα比值于辐射后14d显著升高(P<0.01),p-mTOR Ser2448/mTOR比值于辐射后7d显著降低(P<0.01)。六、原代大鼠海马神经元和NGF诱导的PC12细胞突触可塑性变化1.突起形态:与SH组相比,辐射后6h和24h,MW组PC12细胞突起缩短,细胞之间的连接断裂。2.EPSC:与SH组相比,MW组原代大鼠海马神经元EPSC电流密度于辐射后6h明显降低(P<0.05)。3.神经递质Glu和GABA:与SH组相比,MW组PC12细胞培养液中Glu含量于辐射后1h显著降低(P<0.01);GABA含量于辐射后6h显著升高(P<0.01);Glu和GABA的比值于辐射后1h和6h显著降低(P<0.01)。七、PC12细胞自噬形态、标志物和相关基因改变1.自噬形态:SH组PC12细胞偶见自噬体和自噬溶酶体,MW组自噬体和自噬溶酶体数量于辐射后6h明显增多。2.自噬标志物和相关基因:与SH组相比,辐射后6h,氯喹未处理时,MW组PC12细胞浆内LC3点状聚集数量未见明显改变(P>0.05);氯喹预处理后,MW组LC3点状聚集数量显著增多(P<0.01),即LC3通量增加;Beclin1于辐射后6h表达明显上调(P<0.05);LAMP1于辐射后12h和24h表达显著升高(P<0.01),Atg5、Atg7和Atg9于辐射后6h和12h表达明显增加(P<0.05或P<0.01)。八、PC12细胞AMPK/mTOR通路关键分子改变与SH组相比,MW组PC12细胞p-AMPKαThr172/AMPKα比值于辐射后6h和12h明显升高(P<0.05或P<0.01);p-mTOR Ser2448/mTOR比值于辐射后6h明显降低(P<0.05)。九、AMPK/mTOR干预经微波辐射后PC12细胞自噬改变1.Dorsomorphin干预经微波辐射后PC12细胞AMPK表达和自噬:与单独辐射组相比,辐射后6h,Dorsomorphin与微波辐射联合作用组PC12细胞p-AMPKαThr172/AMPKα比值显著降低(P<0.01);氯喹未处理时,细胞浆内LC3点状聚集数量未见明显改变(P>0.05),氯喹预处理后,LC3点状聚集数量显著减少(P<0.01),即LC3通量减少。2.Rapamycin干预经微波辐射后PC12细胞mTOR表达和自噬:与单独辐射组相比,辐射后6h,Rapamycin与微波辐射联合作用组PC12细胞p-mTOR Ser2448/mTOR比值显著降低(P<0.01);氯喹未处理时,细胞浆内LC3点状聚集数量未见明显改变(P>0.05),氯喹预处理后,LC3点状聚集数量显著增加(P<0.01),即LC3通量增加。十、自噬干预经微波辐射后PC12细胞突触可塑性改变1.LY294002干预经微波辐射后PC12细胞自噬和突触可塑性:与单独辐射组相比,辐射后6h,LY294002与微波辐射联合作用组PC12细胞,氯喹未处理时,细胞浆内LC3点状聚集数量未见明显改变(P>0.05),氯喹预处理后,LC3点状聚集数量显著减少(P<0.01),即LC3通量减少;细胞形态和功能明显损伤,表现为细胞表面粗糙、突起消失,GABA释放增加(P<0.01)。2.Rapamycin干预经微波辐射后PC12细胞自噬和突触可塑性:与单独辐射组相比,辐射后6h,Rapamycin与微波辐射联合作用组PC12细胞LC3通量增加;细胞形态未见明显异常,GABA释放减少(P<0.01)。结论一、30mW/cm~2微波辐射可引起大鼠认知功能障碍和突触可塑性损伤,表现为空间学习和记忆能力下降、脑电活动抑制,海马LTP诱导障碍、Glu和GABA代谢紊乱、神经元突触囊泡减少、突触间隙模糊和突触后致密物增加。二、30mW/cm~2微波辐射可引起大鼠海马神经元自噬活化及增多,表现为自噬体和自噬溶酶体增多,自噬标志物LC3-II和LC3-I比值升高,Beclin1和LAMP1表达上调,自噬相关基因Atg5和Atg9激活。三、30mW/cm~2微波辐射可引起大鼠海马神经元自噬体和突触囊泡共定位增加,自噬介导突触囊泡的降解参与微波辐射致突触可塑性损伤的病理生理过程。四、建立了微波暴露致突触可塑性损伤和自噬活化的细胞模型,突触可塑性损伤表现为神经元突起缩短、突起之间的连接断裂,EPSC抑制、Glu和GABA释放紊乱;自噬激活表现为自噬体和自噬溶酶体增多,LC3通量增加,Beclin1、LAMP1和自噬相关基因Atg5、Atg7和Atg9表达增加。五、自噬相关通路信号分子AMPK磷酸化激活和mTOR磷酸化抑制是微波辐射致神经元自噬活化的重要机制。六、微波辐射所致神经元自噬对突触可塑性损伤发挥保护作用。抑制自噬加重微波辐射所致PC12细胞损伤;激活自噬引起微波辐射后PC12细胞GABA释放减少。