结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生命和健康。近年来随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，结直肠癌的发病率在全球范围内呈逐年增加的趋势。全球每年新增病例1，200，000例，每年死亡病例608，700例，其中澳大利亚、新西兰、欧洲和北美洲发病率最高，在中国结直肠癌发病率在恶性肿瘤中仅次于肺癌和胃癌居第三位，死亡率居第五位。研究表明，如果结直肠癌能在早期阶段被发现，约90％的病人可以通过外科手术治愈，但由于绝大多数患者发病早期无明显症状，经常是在进展期才被诊断，所以严重影响了结直肠癌的治疗和预后，因此，加强寻找与结直肠癌的发生、发展及预后相关的分子标志物对其早期诊断、临床分期、个体化治疗方案制定及预后评估具有重要临床意义。　　酪氨酸磷酸化是信号传导级联反应中的重要调节步骤，参与调控细胞的增殖、生存、分化、迁移和凋亡等过程。酪氨酸磷酸化由蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosinephosphatases，PTPs)协同调控，当PTP表达或活性调控失常时，可导致信号通路紊乱，从而促进多种疾病的发生，包括肿瘤、糖尿病和炎症等。PTP1B是PTPs超家族成员之一，最初是作为一个分子量为37KDa的催化结构域从人胎盘组织中所提取，PTP1B基因定位于人20号染色体q13，在许多癌症中发现该区域存在癌基因和基因增殖。PTP1B是一种典型的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶，在代谢信号通路中起重要作用，被认为是抗2型糖尿病和肥胖的潜在靶点。越来越多的研究表明PTP1B与肿瘤具有相关性，最近的多数研究表明，其在肿瘤的发生中具有促进作用。例如，PTP1B在胃癌细胞中过表达，抑制PTP1B的表达在体内外可明显抑制胃癌细胞的生长，PTP1B在胃癌组织中的过表达与肿瘤转移和TNM分期密切相关。此外，PTP1B还在多种肿瘤中存在过表达，如上皮来源的肿瘤、卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌。然而也有研究表明PTP1B可能是个肿瘤抑制因子，与癌旁正常粘膜相比，PTP1BmRNA在食管癌中的表达明显下降。因此PTP1B在肿瘤的发生中的作用仍存争议，需要进一步探讨。关于PTP1B与结直肠癌关系，有研究表明，PTP1B在结肠癌细胞中过度表达，其过表达可通过激活Src增强结肠癌细胞的致瘤性。另有研究表明，shRNA-PTP1B有效沉默结肠癌LoVo细胞PTP1BmRNA及蛋白的表达。然而，有关PTP1B在人类结直肠癌组织中的表达、PTP1B表达与临床病理参数和预后的关系及PTP1B在结直肠癌中作用目前鲜有报道。　　细胞信号转导通路的异常激活是肿瘤细胞的重要生物学特性。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinaseB，PKB或Akt)信号途径是一条与细胞的生长、增殖和分化密切相关的信号转导通路。近年来研究表明，该通路在人类多种肿瘤的发生发展中起着重要作用。其异常激活不仅可导致细胞的恶性转化，而且在肿瘤血管形成、肿瘤的浸润和转移及肿瘤细胞的凋亡中起重要作用。研究表明，PTP1B可激活c-Src蛋白，而c-Src蛋白可激活与细胞存活相关的PI3K/AKT通路。黏着斑激酶(FAK)是一种非受体蛋白酪氨酸激酶，参与细胞发育、生长、凋亡等过程的调控，FAK信号转导途径被认为是细胞内信号传导的一个交汇点。近年来研究表明，在多种肿瘤组织中都有FAK蛋白表达的显著增加，FAK介导的信号转导通路在肿瘤发生发展及侵袭转移过程中发挥着重要作用，研究显示，抑制PTP1B的活性能明显降低FAK的磷酸化。　　细胞的增殖和凋亡失衡与肿瘤的发生发展密切相关，Ki67是一种由MKI67基因编码的核蛋白，在细胞周期G2、S、G1和M期均有表达，而G0期缺如。该蛋白与细胞增殖和核糖体RNA的转录相关。Ki67常用来评价肿瘤的增殖状态，由于增殖状态与肿瘤侵袭性密切相关，所以Ki67被作为多种肿瘤的预后标记物。生存素(Survivin)属于凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族，是新近发现的一种凋亡抑制因子，具有抑制细胞凋亡和调节细胞增殖的双重作用。Survivin表达于胚胎和发育的胎儿组织，成人终末分化组织无表达，但在多种人类常见恶性肿瘤中高表达，包括胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌，与肿瘤的侵袭性和临床进展过程有关。　　为了探讨PTP1B在结直肠癌中表达的临床意义及其与PI3Kp85α、AKT2、FAK、Survivin、Ki67的相关性，本研究应用免疫组织化学法、Western blot及实时荧光定量PCR技术检测结直肠癌组织和对应癌旁正常组织中PTP1B蛋白和mRNA的表达，结合病例临床病理资料，分析其与各临床病理参数及预后的关系。用实时荧光定量PCR检测结直肠癌组织和对应癌旁正常组织中PI3K/AKT信号通路中PI3Kp85α、Akt2的mRNA表达、FAK信号通路中FAK的mRNA表达、增殖相关抗原Ki67及凋亡相关基因Survivin的mRNA的表达，并采用Western blot法验证PI3Kp85α、Akt2、FAK、Survivin蛋白水平的表达，分析PTP1B mRNA与PI3Kp85α、Akt2、FAK、Survivin和Ki67的mRNA表达的相关性。为结直肠癌的早期诊断、临床治疗和预后评估提供了一定的理论依据。　　本课题三部分的具体内容如下:　　第一部分、PTP1B在结直肠癌中的表达及其临床意义　　目的:检测PTP1B蛋白在结直肠癌组织中的表达，探讨其与结直肠癌各临床病理因素及预后之间的关系，为评估结直肠癌的发生发展、预后及治疗提供理论依据。　　方法:运用免疫组织化学技术检测PTP1B蛋白在96例结直肠癌组织及对应癌旁正常组织中的表达情况，分析其与患者性别、年龄、肿瘤发病部位、分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期及预后的关系。用统计软件SPSS16.0进行统计学分析。　　结果:　　(1)PTP1B在62例结直肠癌组织和27例对应癌旁无癌组织中呈高表达，而在34例结直肠癌组织和69例对应癌旁无癌组织中低表达或阴性表达，卡方检验显示组间差异性有统计学意义(x2=25.65，P＜0.01)。　　(2)PTP1B在结直肠癌组织中的表达与肿瘤分化程度(x2=4.084，P=0.043)，浸润深度(x2=4.608，P=0.032)，淋巴结转移(x2=5.061，P=0.024)，TNM分期(x2=5.724，P=0.017)有关，而与性别、年龄和肿瘤部位无关（P＞0.05）。　　(3)Kaplan-Meier分析显示，PTP1B高表达的患者生存期短于低表达患者(P=0.012)。单因素分析结果显示，PTP1B高表达(P=0.018)，TNM分期(P＜0.001)，淋巴结转移(P＜0.001)，浸润深度(P=0.012)，分化程度(P=0.001)与不良预后相关。Cox模型多因素分析结果显示，PTP1B表达(P=0.045)，TNM分期(P=0.015)，淋巴结转移(P=0.014)是结直肠癌预后的独立因素。　　结论:　　(1)PTP1B蛋白在结直肠癌组织中的表达显著高于对应癌旁正常组织，并与分化程度、浸润深度、淋巴结转移和临床分期有关，PTP1B在结直肠癌的发生发展及浸润转移中起促进作用。　　(2)PTP1B蛋白在结直肠癌组织中的表达与患者的年龄、性别及肿瘤部位无关。　　(3)PTP1B是判断结直肠癌预后的独立因素。　　第二部分、结直肠癌中PTP1B表达与PI3Kp85α、Akt2和FAK表达的相关性研究　　目的:检测PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK mRNA在结直肠癌及对应癌旁正常组织的表达水平，并验证其蛋白在在结直肠癌及对应癌旁正常组织中的表达。分析上述指标mRNA表达水平与结直肠癌患者临床病理参数的关系以及结直肠癌组织中PTP1BmRNA表达与PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA表达的相关性，探讨结直肠癌组织中PTP1B与PI3K/Akt和FAK两大细胞信号转导通路中相关分子的关系。　　方法:采用实时荧光定量PCR技术检测结直肠癌组织及对应癌旁正常组织中的PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA表达水平，并采用Western blot法验证PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK蛋白水平的表达，分析PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA表达与患者性别、年龄、肿瘤发病部位、分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况及TNM分期的关系。分析结直肠癌组织中PTP1BmRNA表达与PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA表达的相关性，应用SPSS16.0统计学软件对实验数据进行分析。采用配对t检验对PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA在结直肠癌组织及对应癌旁正常组织中表达的差异进行分析;采用两个独立样本t检验法检验上述基因与患者不同临床病理参数间的关系;采用Pearson相关分析检测PTP1BmRNA与PI3Kp85α、Akt2、FAK的mRNA表达的相关性。P＜0.05为差异具有统计学意义。　　结果:　　(1)PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA在结直肠癌组织中的表达水平均高于对应癌旁正常组织，差异均具有统计学意义(均P＜0.01)。　　(2) PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK蛋白在结直肠癌组织中的表达明显高于对应癌旁正常组织中的表达。　　(3)PTP1BmRNA在结直肠癌组织中的表达与肿瘤分化程度(t=3.288，P＜0.01)，浸润深度(t=4.613，P＜0.01)，淋巴结转移(t=4.841，P＜0.01)，TNM分期(t=4.841，P＜0.01)有关，而与性别、年龄和肿瘤部位无关(P＞0.05）。　　(4)PI3Kp85α mRNA在结直肠癌组织中的表达与浸润深度(t=2.972，P＜0.01)，淋巴结转移(t=2.106，P＜0.01)，TNM分期(t=2.106，P＜0.01)有关，而与性别、年龄、肿瘤部位和肿瘤分化程度无关(P＞0.05)。　　(5)Akt2 mRNA在结直肠癌组织中的表达与浸润深度(t=2.843，P＜0.01)，淋巴结转移(t=2.335，P＜0.01)，TNM分期(t=2.335，P＜0.01)有关，而与性别、年龄、肿瘤部位和肿瘤分化程度无关（P＞0.05）。　　(6)FAK mRNA在结直肠癌组织中的表达与浸润深度(t=3.805，P＜0.01)，淋巴结转移(t=3.254，P＜0.01)，TNM分期(t=3.254，P＜0.01)有关，而与性别、年龄、肿瘤部位和肿瘤分化程度无关(P＞0.05）。　　(7)PTP1B与PI3Kp85α、Akt、FAK的mRNA表达均呈正相关关系，相关系数分别为，PTP1B-PI3Kp85α: r=0.576, P＜0.01; PTP1B-Akt2:r=0.649,P＜0.01;PTP1B-FAK: r=0.702,P＜0.01。　　结论:　　(1)PTP1B、PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA及蛋白在结直肠癌组织中的表达水平均高于对应癌旁正常组织，提示它们可能均参与了结直肠癌的发生。　　(2)癌组织分化程度越低、浸润程度越深、临床分期越高以及有淋巴结转移的结直肠癌组织中PTP1BmRNA相对表达量越高，说明PTP1B可能参与了结直肠癌的侵袭转移和恶化。　　(3)浸润越深、临床分期越高以及有淋巴结转移的结直肠癌组织中PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA相对表达量越高，说明三者可能与结直肠癌的侵袭转移和恶化密切相关。　　(4)PTP1B mRNA与PI3Kp85α、Akt2和FAK的mRNA在结直肠癌中的表达均具有正相关关系，提示它们可能在结直肠癌的发生发展、浸润和转移过程中具有协同作用。　　(5) PTP1B在结直肠癌的高表达可能与PI3K/AKT和FAK所介导的信号通路异常激活有关。　　第三部分、结直肠癌组织中PTP1B表达与Survivin和Ki67表达的相关性研究　　目的:检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中Survivin和Ki67的mRNA表达情况，并采用Western blot法验证Survivin蛋白水平的表达，分析Survivin和Ki67mRNA表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系，以及结直肠癌组织中PTP1BmRNA表达与Survivin和Ki67的mRNA表达的相关性，探讨结直肠癌组织中PTP1B表达与增殖和凋亡的关系。　　方法:采用实时荧光定量PCR技术检测结直肠癌组织及对应癌旁正常组织中的Survivin和Ki67的mRNA表达水平，并采用Western blot法验证Survivin蛋白水平的表达，分析Survivin和Ki67的mRNA表达与患者性别、年龄、肿瘤发病部位、分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期的关系以及结直肠癌组织中PTP1BmRNA表达与Survivin和Ki67的mRNA表达的相关性。应用SPSS16.0统计学软件对实验数据进行分析。采用配对t检验对Survivin和Ki67的mRNA在结直肠癌组织及对应癌旁正常组织中表达的差异进行分析;采用两个独立样本t检验法检验上述基因与患者不同临床病理参数间的关系;采用Pearson相关分析检测PTP1BmRNA与Survivin、Ki67的mRNA表达的相关性。P＜0.05为差异具有统计学意义。　　结果:　　(1)Survivin和Ki67的mRNA在结直肠癌组织中的表达水平均高于对应癌旁正常组织，差异均具有统计学意义(均P＜0.01)。　　(2) Survivin蛋白在结直肠癌组织中的表达明显高于对应癌旁正常组织中的表达。　　(3)Survivin mRNA在结直肠癌组织中的表达与浸润深度(t=2.421，P＜0.01)，淋巴结转移(t=3.086，P＜0.01)，TNM分期(t=3.086，P＜0.01)有关，而与性别、年龄、肿瘤部位和肿瘤分化程度无关（P＞0.05）。　　(4)Ki67 mRNA在结直肠癌组织中的表达与淋巴结转移(t=2.356，P＜0.01)，TNM分期(t=2.356，P＜0.01)有关，而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分化程度和浸润深度无关(P＞0.05）。　　(5)PTP1B与Ki67和Survivin的mRNA表达均呈正相关关系，相关系数分别为，PTP1B-Ki67:r=0.398，P＜0.05; PTP1B-Survivin: r=0.615，P＜0.01。　　结论:　　(1)Survivin和Ki67的mRNA在结直肠癌组织中的表达水平均高于对应癌旁正常组织，提示它们可能均参与结直肠癌的发生。　　(2)癌组织浸润越深、临床分期越高以及有淋巴结转移的结直肠癌组织中SurvivinmRNA相对表达量越高，说明Survivin可能参与了结直肠癌的侵袭转移。　　(3)临床分期越高以及有淋巴结转移的结直肠癌组织中Ki67的mRNA相对表达量越高，说明Ki67可能参与了结直肠癌的侵袭转移。　　(4)PTP1BmRNA与Survivin和Ki67的mRNA在结直肠癌中的表达均具有正相关关系，提示它们在促进结直肠癌的发生发展，浸润和转移中具有协同作用。　　(5) PTP1B在结直肠癌的高表达可能与肿瘤细胞的增殖和凋亡相关。