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酵母表面展示技术(Yeast surface display technology)作为真核展示系统,已逐渐成为现代生命科学领域一种十分有效的展示技术。近十几年来,随着酵母表面展示技术的不断改进和完善,该技术在许多领域都得到了广泛应用。其中利用毕赤酵母表面展示技术展示各种功能蛋白具有更大的优越性,在国内外研究中都取得了较大进展。南极假丝酵母脂肪酶B在众多脂肪酶是途最为广泛的一种,对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。将其展示于毕赤酵母表面展示,不但实现了自固定化,耐热性和催化活性也有改善。但对展示于毕赤酵母的表面的酶的发酵优化,特别是针对展示于毕赤酵母的南极假丝酵母脂肪酶B,国内外尚未报道。本研究的思路是根据Invitrogen公司提供的《毕赤酵母实验操作手册》和《毕赤酵母发酵工艺手册》,分别先在摇瓶水平对培养基主要成分和发酵条件进行单因素优化,找到最适水平的同时发现关键因素。然后再放大到2L规模,并利用发酵罐探索甘油和甲醇补料的最佳流加模式,最后在50L的发酵罐实现放大。本研究首先对表面展示CALB的毕赤酵母突变菌株KFS-CALB-GS115摇瓶水平的BMGY/BMMY培养基及发酵条件进行了单因素优化,发现KFS-CALB-GS115摇瓶水平的最适培养基条件及发酵条件为甘油添加量2%(w/v),甲醇添加量2%(v/v),接种量4%(v/v),装液量12.5mL,转速300rpm诱导初始pH=6.5, KFS-CALB-GS115水解酶活力明显高于原条件,达到916.3U/g,相比原条件556.9 U/g提高了65%。通过对比优化前后全细胞催化合成己酸乙酯的合成效率发现,反应3h后,优化条件下的底物转化率达到70%,而原条件下只有28%,同时优化条件下4小时转化率就能达到80%以上,比原条件提前1.5h以上。对比优化前后KFS-CALB-GS115的蛋白表达量可以看出,优化条件下的蛋白条带清晰度略好于原条件。本研究同时对另一株表面展示CALB的毕赤酵母突变菌株KNS-CALB-GS115(比KNS-CALB-GS115合成活力更高,但水解活力偏低)高密度发酵的BSM培养基及相应发酵条件进行了优化。首先通过摇瓶模拟发酵罐的甘油分批培养,考察了BSM培养基中几种重要成分的含量,然后利用多功能补料摇床能够在线检测并且自动控制发酵pH的优点,分别考察了KNS-CALB-GS115在生长和产酶阶段分别的最适pH值和最适温度。通过单因素实验发现,KNS-CALB-GS115摇瓶水平的最适BSM培养基条件及发酵条件为:甘油含量40g/L,硫酸铵含量4 g/L,硫酸钙含量10 mmol/L,PTM1含量4 mL/L,最适生长和产酶温度30℃,最适生长pH=5.5,最适产酶pH=7.0。优化后甘油利用率高6.4%,达到95.3%,菌体干重提高4.5%达到19.92g/L,CALB水解活力提高60.3%达到100.3 U/g。然后,将KNS-CALB-GS115的BSM培养基的主要成分和培养条件的优化应用于在2L发酵罐条件下,能够有效提高菌体的生长效率,对后期菌体的产酶起到促进作用。最高酶活力可达305.9U/g,较未优化条件下相比,单位菌体酶活力提高了27.2%。提高甘油流加阶段的流速至9.6mL/(L?h)并延长流加甘油的时间至12h能够有效地快速富集菌体,菌体量的增加有效地提高了了后期酶表达量。菌体最优的酶活力可以达到317.3U/g;采取6.4mL/(L?h)恒速流加甲醇的方式比恒定溶氧法菌体上的CALB表达量有效提高,菌体最优的酶活力可以达到348.4U/g;通过对比优化前后细胞表面荧光强度,优化后的荧光峰明显向右漂移,验证了展示酶活力的提高是由于细胞表面蛋白表达量有了提高;通过对比优化前后CALB全细胞催化合成己酸乙酯合成效率,在反应开始1h左右转化率可以提高18%。说明优化条件下CALB表达量的提高可以明显提高单位菌体的催化合成活性。采用50L发酵罐扩大培养,酶活力达到256.5U/g,低于2L发酵罐水平,并未达到预期的放大效果。