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目的:
1、探讨白英水提取液诱导人大肠癌HT29细胞凋亡的机制。
2、探讨白英水提取液对Notchl基因的影响。
方法:
1、取白英全草干品浸泡、煎熬、过滤、浓缩,获取白英水提取液。
2、体外培养人大肠癌HT29细胞,实验随机分为正常对照组、白英处理组(浓度分别为1.25、2.5、5mg/mL)和阳性对照组(羟基喜树碱浓度为10μg/mL)。
3、白英水提取液分别作用人大肠癌HT29细胞24h、48h和72h后,采用细胞毒(MTT法)实验检测OD值,计算对照组和各实验组人大肠癌HT29细胞的抑制率和IC50值。
4、不同浓度的药物处理24h后,用光学显微镜和电镜观察细胞形态变化。
5、不同浓度的药物处理24h后,应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
6、不同浓度的药物处理24h后,半定量RT-PCR法检测caspase-8、NotchlmRNA的表达。
结果:
1、MTT检测结果表明白英水提取液各浓度组人大肠癌HT29细胞增殖抑制率显著升高,且呈一定的剂量和时间依赖性。浓度分别为1.25、2.5、5mg/mL的白英水提取液和浓度为10μg/mL的羟基喜树碱处理人大肠癌HT29细胞24h,细胞抑制率分别为(14.08±3.02)%、(35.98±3.62)%、(59.18±5.84)%和(52.90±5.05)%:处理48h,细胞抑制率分别为(24.09±3.90)%、(57.15±3.99)%、(78.95±5.70)%和(71.61±5.32)%;处理72h,细胞抑制率分别为(45.61±6.22)%、(70.05±2.46)%、(89.23±2.14)%和(87.83±2.01)%;白英水提取液处理大肠癌HT29细胞24h、48h和72h的IC50分别为3.83、2.29和1.42mg/mL。
2、光镜下可见,在加入白英水提取液和羟基喜树碱后,细胞增殖减慢,出现皱缩、脱壁、漂浮现象。电镜下可见白英处理组细胞体积缩小,核染色质凝聚、边集,出现核碎片、凋亡小体等细胞凋亡现象。
3、流式细胞仪检测结果显示,正常对照组人大肠癌HT29细胞凋亡率为(3.43±0.40)%,白英水提取液各浓度组与羟基喜树碱组HT29细胞凋亡率分别为(9.14±1.59)%,(21.55±2.03)%,(40.10±2.53)%和(39.67±2.82)%,与正常对照组相比有显著性差异(P<0.01),且呈明显的剂量效应关系。
4、半定量RT-PCR检测结果显示,随着白英水提取液浓度的升高,caspase-8mRNA表达上调,Notchl mRNA表达下调。1.25、2.5、5mg/mL白英处理组caspase-8/β-actin光密度积分值之比分别0.382±0.023、0.545±0.045和0.723±0.015,与正常对照组0.204±0.043相比有显著差异(P<0.001)。Notchl/β-actin光密度积分值之比分别为0.518±0.019、0.437±0.024和0.239±0.041,与正常对照组0.648±0.019相比有显著差异(P<0.01或P<0.001)。
结论:
1、白英水提取液对人大肠癌HT29细胞增殖有较强的抑制作用,且这种作用呈一定的剂量和时间依赖性。
2、白英水提取液具有诱导人大肠癌HT29细胞凋亡的作用,且细胞凋亡率呈明显的剂量效应关系。诱导细胞凋亡可能是白英水提取液抗肿瘤作用的机制之一。
3、白英水提取液能上调caspase-8基因的mRNA水平,其诱导人大肠癌HT29细胞凋亡可能与死亡受体通路有关。
4、白英水提取液能下调Notchl基因的mRNA水平,提示白英水提取液可能通过影响Notch信号途径从而抑制人大肠癌HT29细胞的增殖,促进细胞凋亡。