乙烯应答因子ERF11转录调控BT4调节拟南芥对丁香假单胞菌的抗性

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转录调控在植物识别病原菌后所触发的防御反应中发挥着重要作用。转录因子作为转录调控的功能蛋白,通过激活或者抑制下游抗病相关基因的表达来调节植物的抗病性。ERF(Ethylene Responsive Factor)转录因子和BT(BTB and TAZ protein)蛋白作为植物特异的高度保守的功能蛋白,在植物生长发育、生物及非生物胁迫过程中扮演着重要的角色。然而,ERF转录因子和BT蛋白在拟南芥抵抗半活体营养型病原菌的研究中仍少有报道。因此,本研究筛选并鉴定了参与拟南芥与丁香假单胞菌互作过程的ERF转录因子和BT蛋白,明确了这两个功能蛋白在抗病过程中的作用以及两者之间的调控关系。为阐明植物抗病信号途径奠定了理论基础,同时也对农作物抗病品种的培育提供了理论依据。主要研究结果如下:1.利用NCBI中GEO数据库,在3个与抗病相关的转录组数据中,发现AtERF11基因在水杨酸(salicylic acid,SA)、Pseudomonas syringae pv.tomato(Pst)DC3000处理后表达改变2倍以上;在水杨酸合成基因突变体sid2相关转录组数据中,AtERF11基因表达下调,推测AtERF11可能与SA调控的抗病途径相关。分析AtERF11启动子发现其含有SA、JA、ABA、GA、ET以及防御和胁迫相关的应答元件。抗病相关激素SA、JA、ACC以及病原菌Pst DC3000处理均会诱导AtERF11基因的表达。在SA合成和信号突变体sid2、npr1-1,转基因植株NahG,乙烯信号突变体ein2、ein3、ein3eil1中,SA、ACC和Pst DC3000对AtERF11基因的诱导则受到明显的抑制;表明AtERF11可能受到SA和ET信号的调控。对AtERF11的抗病功能研究发现,与Col-0相比,erf11突变体表现为感病症状,过表达ERF11转基因植株表现为明显的抗病表型。检测Pst DC3000侵染过程中下游抗病相关基因的表达情况,发现在erf11突变体中,PR1、PR2、PR5基因的表达水平较低,过表达ERF11转基因植株中表达水平较高。检测Pst DC3000侵染时叶片中活性氧ROS和抗坏血酸AsA的含量,发现erf11突变体中的超氧阴离子和H2O2含量较低而AsA含量较高,过表达AtERF11转基因植株超氧阴离子和H2O2含量较高但AsA含量较低;增强或者抑制AtERF11基因表达影响Pst DC3000侵染过程中活性氧产生关键基因RBOHD以及AsA合成关键基因VTC1和MIXO4的表达。这些结果均表明AtERF11正调控拟南芥对Pst DC3000的抗性过程。进一步研究发现,AtERF11功能缺失可以影响SA诱导的拟南芥抗病性的增强以及下游抗病基因PR1、PR2、PR5的表达。2.对AtERF11的基本特性分析,发现AtERF11定位于细胞核并且在酵母中具有转录激活活性;通过原生质体瞬时表达试验和酵母单杂交试验发现,AtERF11可以与ERF转录因子特异结合序列GCC-box和DRE元件相互作用。从而确定了AtERF11具有转录因子的基本特性。测定erf11突变体和过表达AtERF11转基因植株中5个BTs家族成员基因的表达情况,发现AtERF11可能调控AtBT4基因的表达。进一步利用烟草瞬时表达系统,确定了AtERF11可以激活AtBT4基因的表达。通过酵母单杂交和凝胶迁移率阻滞试验,发现转录因子AtERF11的N端可以与AtBT4起始密码子上游-2065bp启动子区中的GCC-box相互作用,从而调控AtBT4基因的表达。3.试验进一步对AtBT4在拟南芥抵抗Pst DC3000侵染过程中的作用进行研究。发现抗病相关激素SA、JA、ACC以及Pst DC3000处理均可诱导AtBT4基因的表达。在SA合成和信号突变体sid2、npr1-1以及转基因植株NahG中,AtBT4基因表达水平略微降低,SA诱导AtBT4表达水平也相应的降低。在茉莉酸合成突变体jar1中,AtBT4表达没有明显差异,而JA诱导的AtBT4表达量明显减少。在乙烯信号突变体ein2、ein3、ein3 eil1中,AtBT4基因表达水平降低,同时ACC诱导的AtBT4基因表达也受到抑制;在转基因植株EIN3 OX以及乙烯过量合成突变体eto1中,AtBT4基因表达水平明显增强;ACC诱导的AtBT4表达水平也呈现上升趋势。同样,在SA、JA、ET信号和合成突变体中,Pst DC3000诱导的AtBT4基因表达受到明显抑制,表明AtBT4可能受到SA、JA以及ET信号的调控。对AtBT4的相关植株抗病性进行分析,发现bt4突变体表现为明显的感病症状,过表达AtBT4转基因植株表现为明显的抗病表型;在Pst DC3000侵染时,bt4突变体中PR1、PR2、PR5基因的表达水平明显低于Col-0,而过表达AtBT4转基因植株中PR1、PR2、PR5基因的表达水平明显高于Col-0。检测Pst DC3000侵染时叶片中ROS和AsA的含量,发现bt4突变体中超氧阴离子和H2O2含量较低而AsA含量较高,过表达AtBT4转基因植株超氧阴离子和H2O2含量较高但AsA含量较低;改变AtBT4基因表达没有影响Pst DC3000侵染过程中活性氧产生关键基因的表达,影响了AsA合成关键基因VTC1和MIXO4的表达。同时发现AtBT4功能缺失可以影响SA诱导的拟南芥抗病性的增强以及下游抗病基因PR1、PR2、PR5的表达。
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