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花青素是自然界中广泛存在于植物中的一类水溶性天然色素,属于类黄酮化合物。研究显示花青素的生物合成途径基因主要受MYB、bHLH、WD40三类转录因子及其转录复合物的调控。甘蓝是一种重要的十字花科蔬菜植物,常见有紫球甘蓝和绿球甘蓝两种类型,紫球甘蓝能自然积累花青素而绿球甘蓝一般在缺肥、低温等逆境条件胁迫下会大量积累花青素。bHLH、WD40转录因子在大量的植物中被认为参与了包括花青素的生物合成以及种子种皮色素积累,而这两个转录因子在绿球甘蓝中如何调控花青素合成的机制研究较少。另外,针对bHLH、WD40转录因子是否影响植物开花时间的研究尚未见报道。本试验将甘蓝中WD40及TT8转录因子融合到EAR基序抑制域(SRDX),构建pCABarTT8ER、pCABarWD40ER、pCABarTT8-WD40ER表达载体转化甘蓝,研究了甘蓝TT8、WD40转录因子在植株中花青素积累以及开花调控途径中的功能。本试验中获得的主要结果如下:1、pCABarTT8ER、pCABar WD40ER、pCABarTT8-WD40ER转基因甘蓝植株的获得通过农杆菌介导法分别将植物表达载体pCABarTT8ER、pCABarWD40ER、pCABarTT8-WD40ER转化甘蓝,经过含8 mg/L草铵膦(PPT)培养基多轮筛选,最终获得转基因甘蓝植株。转基因甘蓝植株PCR鉴定结果显示目的基因被成功整合到甘蓝基因组中。2、pCABarTT8ER、pCABarWD40ER、pC ABarTT8-WD40ER转基因甘蓝叶片中花青素代谢途径相关结构基因的表达分析分别取pCABarTT8ER、pCABarWD40ER、pCABarTT8-WD40ER转基因甘蓝叶片进行花青素积累相关结构基因的实时荧光定量分析。结果显示pCABarTT8ER、pCABar WD40ER植株叶片与野生型植株之间无明显差异,但pCABarWD40ER植株中DFR、ANR表达量显著低于野生型,pCABarTT8ER甘蓝中仅ANR表达量明显低于野生型。pCABarTT8-WD40ER转基因甘蓝叶片颜色较野生型浅,与花青素积累相关的CHI、ANS、ANR及UFGT均显著低于野生型植株的表达水平。表明在甘蓝中显性抑制TT8与WD40两个转录因子功能可以引起部分花青素合成结构基因表达量的下降,且在共抑制条件下对花青素合成结构基因表达抑制效果更强。3、pCABarTT8-WD40ER转基因甘蓝种子表型观察及花青素代谢途径相关结构基因的表达分析分别在pCABarTT8-WD40ER转基因甘蓝经蕾期自交授粉后30、40及55天取种子进行表型观察,发现除30天时种子颜色稍弱于野生型外,其他两个时期的种子与野生型种子颜色基本无差异。针对三个时期的种子分别进行花青素积累相关结构基因的实时荧光定量分析显示结构基因表达出现了提高以及降低的情况,表明针对TT8-WD40转录因子功能的显性抑制不影响甘蓝种子种皮色素的积累。4、pCABarTT8-WD40ER转基因甘蓝在低磷、低温胁迫下花青素的积累以及花青素合成相关结构基因的表达分析T1代pCABarTT8-WD40ER转基因甘蓝幼苗与野生型幼苗在低磷胁迫处理后,野生型幼苗在心叶、叶柄、茎基部显示部分紫色而转基因甘蓝植株仍为绿色。进一步进行花青素合成途径相关结构基因表达分析发现DFR、ANS及UFGT表达量极显著低于野生型。表明pCABarTT8-WD40ER转基因甘蓝在低磷胁迫下TT8、WD40转录因子复合物大量表达,导致其靶基因的表达因反式阻抑受到抑制,造成花青素的积累量下降。而低温处理pCABarTT8ER、pCABarWD40ER与野生型甘蓝植株,野生型甘蓝整个植株呈现紫色而转基因植株颜色基本没有变化,进一步说明在逆境胁迫下甘蓝花青素的积累需要转录因子TT8、WD40的参与。5、pCABarTT8ER、pCABarWD40ER、pC ABarTT8-WD40ER转基因甘蓝中与开花早晚相关结构基因的表达分析pCABarTT8-WD40ER转基因甘蓝定植到大田后发现明显的提前开花的现象。对pCABarWD40ER转基因甘蓝进行与开花早晚相关结构基因的荧光定量表达分析后发现春化关键基因VIN3与促花基因SOC1的表达量均显著高于野生型对照。而在pCABarTT8ER转基因植株中VIN3的表达量同样显著高于野生型对照。表明TT8、WD40转录因子单独显性抑制后对甘蓝开花均有一定的促进作用。在T1代pCABarTT8-WD40ER甘蓝中进一步进行与开花早晚相关结构基因的表达分析,结果显示共显性抑制TT8-WD40的功能通过提高春化关键基因VIN3和促花SOC1表达量以及抑制晚开花基因FRI的表达而促进甘蓝提早开花。