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目的真核翻译起始因子4E(eIF4E),是蛋白质合成起始阶段的重要调控因子。该起始因子在多种头颈部肿瘤细胞和组织中不仅高表达,而且与预后呈负相关;同时,eIF4E的过表达状态还与喉癌的发生、发展及其化疗耐药密切相关。首先构建survivin启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)干涉表达载体,转染人头颈部鳞状细胞癌细胞系和脐静脉血管内皮细胞系,验证survivin启动子调控的RNA干涉系统具有肿瘤特异性和高转录活性。构建survivin启动子调控的以eIF4E为靶点的真核表达干涉载体,转染喉癌细胞系(Hep-2),筛选出eIF4E表达下调明显的稳定转染细胞,检测eIF4E表达下调对喉癌细胞的体内和体外增殖活性、细胞周期、细胞凋亡及其化疗敏感性的影响,从而为eIF4E分子成为喉癌治疗的新靶点提供实验性研究基础。方法(1)针对增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)设计有效的siRNA干涉序列,退火后连接到上述载体H1RNA启动子下游形成载体pS-H1P-shEGFP,酶切鉴定。(2)采用PCR方法从构建好的pGL3-surP质粒载体中扩增获得survivin启动子基因,经测序后与Genbank中序列进行比较分析;将survivin启动子基因cDNA克隆到pSUPER.retro.puro干涉载体中替代H1RNA启动子并酶切鉴定,体外合成最小终止信号序列mpA插入到上述载体多克隆位点后面(pS-surP-shRNA-mpA)采用PCR方法从pEGFP-C1载体中扩增cmvP-EGFP-sv40polyA表达框,将该表达框插入到pSUPER.retro.puro中EcoRI和NheI限制性酶切位点之间,形成新的干涉和表达共同载体:pS-surP-shEGFP-mpA-cmvP-EGFP-sv40polyA,经酶切鉴定后分别转染鼻咽癌细胞系CNE-2,喉鳞癌细胞系Hep-2,甲状腺鳞癌细胞系SW579以及脐静脉血管内皮细胞系(ECV304)。转染72小时后,荧光显微镜下观察细胞发光情况;逆转录PCR(RT-PCR)和流氏细胞仪(FCM)分别检测EGFP的转录和荧光发光水平。(3)针对eIF4E cDNA序列设计和体外合成两条有效的siRNA干涉序列,并在BLAST中对靶序列进行同源性分析,退火后插入到pS-surP-shRNA-mpA载体中并酶切鉴定。通过脂质体2000转染喉癌细胞系(Hep-2)中,G418筛选两周后获得稳定转染的细胞。RT-PCR和蛋白印迹方法(Western blotting)分别检测eIF4E mRNA和蛋白表达水平,筛选抑制eIF4E表达最强的稳定转染Hep-2细胞用于进一步的实验研究。(4)蛋白印迹法检测血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF-2)、细胞周期素D1(cyclinD1)的表达变化;MTT法和克隆形成试验检测体外细胞增殖情况;流式细胞技术检测细胞周期变化及细胞凋亡情况;TUNEL染色法检测细胞凋亡变化;检测Caspase-3活性变化以及可能的凋亡机制;体内成瘤性和抑瘤性试验;体外及体内化疗敏感性试验(顺铂)。结果(1)用PCR方法从pGL3-surP质粒载体中扩增出980bp的cDNA,测序证实为人survivin启动子基因;同时酶切鉴定表明survivin启动子基因片断(surP)和mpA中止信号片断成功插入到pSUPER.retro.puro干涉载体中形成新的干涉载体pS-surP-shRNA-mpA。(2)针对EGFP报告基因的真核表达和干涉共同载体构建成功。转染72小时后,RT-PCR结果显示EGFP在CNE-2、Hep-2及SW579细胞中转录表达水平明显低于在ECV304细胞中的转录表达水平;流式细胞仪检测显示EGFP在CNE-2、Hep-2及SW579细胞中蛋白荧光表达水平显著低于在ECV304细胞中的表达水平。(3)针对eIF4E基因的干涉表达载体构建成功。同未转染的Hep-2细胞相比,eIF4E的转录和蛋白表达水平在稳定表达eIF4E/shRNA2的Hep-2-s2细胞中分别抑制了68.5%和59.6%,而在稳定表达eIF4E/shRNA1的Hep-2-s1细胞中则没有明显变化,选择Hep-2-s2细胞用于下一步的试验研究。(4)同未转染的Hep-2细胞相比,血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子及细胞周期素D1在Hep-2-s2细胞中的蛋白表达明显受到抑制;Hep-2-s2细胞的增殖活性明显降低,第7天抑制率达到最大(48.2±1.6%; P<0.01)。Hep-2-s2细胞的体外克隆形成能力明显降低(平均克隆形成数=342; P<0.01);G0/G1期Hep-2-s2细胞比例明显增加而S期细胞比例明显减少;流式细胞仪检测和TUNEL染色结果显示Hep-2-s2细胞凋亡率明显增加(18.3±1.7%; P<0.05);Caspase-3活性明显增加1.21倍;凋亡的产生可能和c-IAP1、c-IAP2、c-myc蛋白表达升高有关系而和Bcl-2家族蛋白表达没有关系; Hep-2-s2细胞的体内成瘤能力明显低于对照组(平均瘤体体积=233.5mm3);pS/surP-eIF4E/shRNA2处理组平均瘤体积(322.5±5.3mm3)显著低于其它处理组;Hep-2-s2细胞对顺铂的体外和体内敏感性明显增强。结论(1) survivin启动子介导的RNA干涉系统能特异而高效的封闭肿瘤细胞内源基因的表达。(2) eIF4E基因表达的下调,能够诱导其下游靶基因的表达下调,体外和体内细胞增殖活性的降低;稳定表达eIF4E/shRNA2的细胞出现了G0/G1期阻滞,凋亡率显著增加;同时eIF4E基因表达的下调能够诱导增强喉癌细胞体内和体外对顺铂的化疗敏感性。(3)肿瘤特异性启动子survivin启动子和RNA干涉系统结合为喉癌靶向性治疗探索了一种新策略,同时靶向性封闭eIF4E基因表达则为喉癌治疗的新靶点开发和逆转化疗耐药开辟了新思路。