基于羧基壳聚糖功能化石墨烯构建眼用葡萄糖生物传感器

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本文主要从以下几方面进行了论述:  第一部分 羧基壳聚糖功能化石墨烯的制备及表征  目的:运用新型简便高产的方法,探索制备生物相容性佳,电化学活性性好,能够直接用于构建生物传感器的功能化石墨烯材料。  方法:使用新型边缘功能化球磨法技术,将鳞片石墨和羧基壳聚糖以1∶5的质量比混合放入行星式球磨机高速球磨,经过一系列的后续处理得到羧基修饰含氮的石墨烯材料。采用原子力显微镜(AFM)、扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱法(FTIR)、拉曼光谱法(Raman)、X射线光电子能谱(XPS)、X射线衍射图谱(XRD)、核磁共振碳谱(C13 NMR)、水接触角法等多种表征方法对产物进行表征。通过导电率和拉曼光谱对制备条件进行优化。通过CCK-8细胞材料毒性试验评价材料的生物相容性。  结果:AFM、SEM、和Raman等结果均证明我们制备得到的羧基壳聚糖边缘功能化石墨烯(Carboxylated chitosan edge functionalized graphene,CG)是具有单层或少层的石墨烯片层结构。FTIR、XPS、XRD、Raman和NMR等理化性能表征结果说明制备的石墨烯材料富含羧基官能团,含有一定比例的氮原子掺杂。导电率和拉曼光谱的结果显示鳞片石墨和羧基壳聚糖在质量比为1∶5,球磨时间为8小时的制备条件下得到的石墨烯质量最佳。水接触角和CCK-8试验结果显示制备得到的石墨烯材料具有良好的亲水性和眼部生物相容性,可以用于眼用生物传感器的构建。  结论:球磨法制备出的羧基壳聚糖边缘功能化石墨烯片层薄,富含羧基,含有一定比例的氮原子掺杂,生物相容性佳,有望应用于眼内生物传感器。  第二部分 基于羧基壳聚糖功能化石墨烯制备的葡萄糖传感器  目的:基于球磨法制备得到的高质量的羧基壳聚糖边缘功能化石墨烯(CG)直接构建高性能葡萄糖生物传感器。  方法:将10mg/ml的CG滴在铂/ITO基片上,室温干燥后,在含0.015M EDC和0.03M NHS的PBS缓冲溶液中(pH=7)浸泡1小时活化羧基。然后在10mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOx)溶液中浸泡1小时,通过CG上的羧基与葡萄糖氧化酶(GOx)中的氨基的共价键反应,固定酶到CG电极。最后采用电化学循环伏安法(CV)确认酶的负载,通过安培滴定法检测传感器各项性能。  结果: CV结果显示有明显的氧化峰,证明葡萄糖氧化酶被成功固定在电极表面。安培滴定法的结果显示所组装的葡萄糖传感器具有非常高的性能,其检测极限可达9.49μM,灵敏度高达9.734μA·mM-1·cm-2,在12.5mM范围内保持很好的线性变化。所制备的葡萄糖传感器的重复性、再现性和稳定性均良好。  结论:基于CG材料制作的葡萄糖生物传感器,制作方法简单,灵敏度高,检测极限低,具有较好的重复性、再现性和稳定性。  第三部分 眼用葡萄糖生物传感器可行性评价  目的:将所制备的CG葡萄糖生物传感器转组装成非侵入式角膜接触镜式葡萄糖传感器,并对其在兔眼眼表配戴的安全性进行评价。  方法:以ERG测试用的角膜电极为模版,采用sputter coating的方法在角膜电极中央部分组装CG石墨烯微电极,并固定葡萄糖氧化酶,得到基于CG的角膜接触镜式葡萄糖传感器。将其配戴在兔眼上,观察配戴前后的眼压变化和角膜荧光染色变化。再用CCK-8法,观察生物传感器材料对人眼角膜上皮细胞的存活率的影响,以综合评价构建眼用生物传感器的可行性。  结果:能够较好的在角膜电极上组装CG生物传感器,构建角膜接触式葡萄糖生物传感器。所制备的传感器模型在兔眼上试戴情况良好。兔子戴镜前,与戴镜2小时、12小时、24小时后的眼压无显著统计学差异,均在正常范围内。兔子戴镜前后的荧光素钠染色情况良好,无明显的眼表损伤。CCK-8法结果显示四种浓度分别为5μg/ml、25μg/ml、50μg/m和100μg/ml的CG材料对人眼角膜上皮细胞的存活率均无明显影响,说明CG材料对人眼角膜上皮细胞无明显毒性。  结论:基于CG制作的非侵入型接触镜式眼用葡萄糖传感器模型对兔眼无明显损伤,安全性可靠,经改进有望应用于人眼泪液的葡萄糖浓度实时监测。
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