1研究背景糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)作为较为严重的糖尿病微血管并发症,对患者的生存质量和经济负担均造成了不良影响。且本病西医尚无特效药物,中医从整体观念出发,随证施药,在提高临床疗效的同时,还可以减轻不良反应。以益气活血法为指导的益气活血中药针对气虚血瘀的基本病机,在本病的治疗中已经体现出一定的效果,然而由于当前临床研究的样本量、方法、质量水平参差不齐,其有效性尚缺乏准确的判断。Meta分析作为循证医学寻求最佳证据的重要手段,或可为解决这一问题提供思路,因此,本研究拟采用Meta分析的方法,对益气活血法治疗DKD的临床疗效进行探讨。以益气活血药为主要组成的肾浊方,是仝小林教授用于治疗DKD的经验方,它基于DKD气虚血瘀的病机,在经方抵挡汤的基础上化裁而来,多年的临床实践表明肾浊方治疗DKD具有良好的效果。然而,由于肾浊方成分多样且在体内的过程复杂,其作用机制尚缺乏系统的研究。网络药理学可以在多组学、高通量筛选技术发展的基础上,运用公共数据库、网络可视化、网络分析等预测药物的机制。因此,本研究采用网络药理学的方法,初步探讨肾浊方防治DKD的作用机制。2研究目的2.1探讨益气活血法治疗DKD的临床效果,为临床实践提供循证医学证据。2.2探讨肾浊方治疗DKD的潜在分子作用机制,为下一步研究提供参考依据。3研究方法3.1益气活血法治疗DKD的Meta分析于中国知网(China national knowledge infrastructure,CNKI)、维普中文科技期刊全文数据库(VIP database for Chinese technical periodicals,VIP)、中国生物医学文献服务数据库(China biology medicine database,CBM)、万方数据库、PUBMED中对2014年1月至2019年12月发表的以益气活血法为指导的益气活血中药治疗DKD相关文献进行检索,设定中文检索词为:“益气活血、益气活血中药、糖尿病肾病”;英文检索词为:“Yiqi Huoxue、benefit qi and activate blood、invigorat qi and activate blood、Diabetic nephropathy、Diabetic kidney diaease、Diabetic Glomerulosclerosis”。依据《Cochrane协作网系统评价员手册5.1.0版》对文献进行筛选,运用Cochrane提供的评价标准对纳入文献进行文献质量评价,同时提取纳入文献的如下信息:第一作者、发表年份、样本量、年龄、病程、性别、干预措施及疗程、尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate,UAER)、24 小时尿蛋白定量(24-hour urinary protein quantity,24hUTP)。采用 Revman 5.2软件对数据进行统计结果分析、发表偏倚分析。3.2基于网络药理学探讨肾浊方治疗DKD的作用机制运用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)、中医药综合数据库(traditional Chinese medicine integrated database,TCMID),结合国内外文献,获取肾浊方的有效成分。通过SwissTargetPrediction、中草药有效成分蛋白靶点数据库(herbal ingredients targets database,HIT)获取肾浊方有效成分的作用靶点,从治疗靶点数据库(therapeutic target database,TTD)、DrugBank、DisGeNet 中收集DKD的靶点。将疾病和药物靶点进行映射后得到“肾浊方-DKD共同靶点数据集”,将其导入String(Version 11.0)数据库,获得潜在靶点之间的作用关系,以“combined_score(综合评分)≥0.9”为筛选标准,将筛选后的靶点信息导入Cytoscape 3.2.1 软件,构建蛋白-蛋白互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,运用Network Analyzer进行网络拓扑分析,以“Degree(自由度)大于等于2倍中位数、Closeness centrality(接近中心性)大于等于中位数、Betweenees centrality(介数)大于等于中位数”为标准,筛选关键靶点,并构建“肾浊方-关键靶点-DKD”网络,根据degree值对其进行可视化。将关键靶点信息导入DAVID数据库,对其进行基因本体论(gene ontology,GO)分析和KEGG通路富集分析,分别用Excel 2003和omicshare tools绘制GO分析条形图和KEGG通路富集分析气泡图。4研究结果4.1益气活血法治疗DKD的Meta分析4.1.1文献检索结果经过文献筛选,共检索出521篇文献,排除重复文献167篇,进而浏览标题、,剔除308篇与纳入标准不符的文献,最后进行文献通读,纳入文献12篇。4.1.2纳入文献特征4.1.2.1一般资料12篇文献共纳入1100例DKD患者,其中治疗组550例,对照组550例。12篇文献中有1篇未报告对照组和治疗组的病程,其余均描述了对照组和治疗组患者的性别、例数、年龄、病程;12篇文献中有1篇疗程为24周,其余均为12周;12篇文献中有8篇文献的治疗组给予益气活血中药+常规治疗,对照组给予常规治疗,3篇文献的治疗组给予益气活血中药+血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)/血管紧张素 Ⅱ 受体阻滞剂(angiotensin Ⅱ receptor blocker,ARB)+常规治疗,对照组给予 ACEI/ARB+常规治疗,1篇文献对照组给予益气活血中药+常规西药治疗,对照组给予ACEI+常规西药治疗;12篇文献均描述对照组和治疗组的一般资料无统计学差异。4.1.2.2中药使用情况本研究纳入的文献均以益气活血法为基础治法,其中使用频次较高的益气活血药物有黄芪(12次)、当归(9次)、白术(7次)、山药(6次)、丹参(6次)、川芎(6次)。4.1.2.3不良反应有2篇文献明确报道无不良反应;1篇文献明确报道有不良反应(对照组恶心、头晕;治疗组头晕、足踝部水肿);其余9篇文献未对不良反应进行描述。4.1.3文献质量评价有16.67%(2/12)的研究使用了错误的随机方法,41.67%(5/12)的研究未描述使用的具体随机方法;12篇文献均未提及分配方案隐藏、盲法使用情况;12篇文献结果数据均完整、没有选择性报告结果、没有其他偏倚来源。4.1.4 Meta分析结果Meta分析结果显示,益气活血中药联合常规西药组DKD患者的UAER(MD=-23.02,95%CI=[-34.82,-11.23],P<0.0001)、24hUTP(MD=-0.44,95%CI=[-0.52,-0.36],P<0.00001)均低于常规西药组,同时益气活血中药联合ACEI/ARB及常规西药组的DKD患者24hUTP低于ACEI联合常规西药组(MD=-0.21,95%CI=[-0.27,-0.15],P<0.00001)。4.1.5文献发表偏倚漏斗图显示,漏斗左右研究分布不对称,呈偏态分布,提示纳入文献的发表偏倚较大。4.2基于网络药理学探讨肾浊方治疗DKD的作用机制4.2.1肾浊方化学成分检索和筛选通过数据库和文献共检索到肾浊方4味中药的428个活性成分,包括TCMSP数据库389个活性成分,TCMID数据库35个活性成分,文献检索4个活性成分。其中TCMSP数据库中的389个活性成分根据“口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,类药性(drug likeness,DL)≥0.18”的标准进行筛选后,共有101个活性成分符合筛选标准。4.2.2肾浊方药物靶点和DKD疾病靶点的筛选(1)肾浊方靶点:通过SwissTargetPrediction、HIT数据库共获得丹参745个靶点、黄芪557个靶点、大黄400个靶点、水蛭378个靶点。(2)DKD靶点:分别从TTD数据库获得DKD靶点20个,从DrugBank数据库获得DKD靶点40个,从DisGeNet数据库获得DKD靶点531个,将三个数据库的靶点信息进行合并并删除重复靶点后,共获得567个DKD靶点。4.2.3肾浊方-关键靶点-DKD网络的构建(1)将肾浊方靶点和DKD靶点进行映射后,共得到182个潜在靶点。(2)将182个潜在靶点导入String,以“combined_score(综合评分)≥0.9”为标准进行筛选后,共获得796对靶点相互作用关系。(3)将从String获得的结果,运用Cytoscape构建PPI网络,进行拓扑分析发现,符合“Degree大于等于2倍中位数(16.0)、Closeness centrality大于等于中位数(0.3761)、Betweenees centrality大于等于中位数(0.00256)”的肾浊方治疗DKD的关键靶点共30个。进而构建“肾浊方-关键靶点-DKD”网络,并根据degree值对其进行可视化,发现肾浊方中的有效成分中的槲皮素、木犀草素、熊果酸、关键靶点中的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、金属蛋白酶-9(metrix metalloproteinases-9,MMP9)、丝裂原活化蛋白激酶 8(mitogen activated protein kinase 8,MAPK8)、磷脂酰肌醇-3 激酶催化亚单位α(phosphoinositide 3-kinase catalytic alpha,PIK3CA)、信号传导与转录活化因子 3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)的 degree 值较高,提示在网络中发挥较重要的作用。4.2.4核心靶点生物功能注释分析(1)通过对30个关键靶点进行GO分析,获得具有意义(以P<0.05)的BP结果85个、MF结果7个、CC结果8个。(2)通过对30个关键靶点进行KEGG富集分析,获得具有意义(以P<0.05)的通路100条,其中DKD相关通路共24条,富集程度较高的通路有肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor,TNF)信号通路、缺氧诱导因子 1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)信号通路、Toll-样受体信号通路。5研究结论(1)本研究通过对纳入的文献进行Meta分析发现,以益气活血法为指导的益气活血中药联合西药使用,在降低DKD患者的UAER、24hUTP方面具有一定的疗效。(2)经网络药理学研究发现,肾浊方是通过多药味、多靶点、多通路的协同作用关系发挥作用,其机制可能是通过有效成分槲皮素、木犀草素、熊果酸,作用于EGFR、MMP9、MAPK8、STAT3靶点,同时尚可能与TNF信号通路、HIF-1信号通路、Toll-样受体信号通路相关。