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PVA（全称polyvinyl alcohol），即聚乙烯醇，是一种人工合成的水溶性的高分子化合物。凭借其诸多优良的物化特性，PVA广泛应用于粘合剂、纤维浆料、纸品加工剂等产品。但是PVA的应用，尤其在纺织和造纸工业中，引发了一系列的环境问题。利用酶法降解PVA不仅能提高PVA的降解效率，亦能降低传统工艺中的能耗、成本和环境污染。但到目前为止，PVA降解酶面临产量低、PVA降解效率差等问题。PVA的降解主要涉及到两个酶，第一步脱氢酶氧化PVA为氧化型PVA，第二步水解酶水解氧化型PVA从而达到降解PVA的目的。本论文以Pseudomonas sp. VM15C和Sphingopyxis sp.113P3来源的两段氧化型PVA水解酶（OPH）基因为研究对象，对其进行克隆表达、晶体结构解析和分子改造，以提高氧化型PVA水解酶的产量和水解反应活力，主要结果如下：（1）氧化型PVA水解酶的高效表达。以Sphingopyxis sp.113P3和Pseudomonas sp.VM15C来源的两段OPH基因（记做sOPH和pOPH）为模板，按照毕赤酵母的密码子偏好性优化，并同时替换大肠杆菌的稀有密码子。将成熟sOPH基因分别在工程菌Escherichiacoli BL21(DE3)和Pichia pastoris GS115中进行克隆表达。对大肠杆菌产sOPH进行发酵条件的优化后，发酵上清液酶活达到47.5U·mL-1，在添加200mmol·L-1甘氨酸的情况下，产率提高到733U·L-1·h-1。对毕赤酵母产sOPH进行了3-L发酵罐的产酶实验，利用低温（22oC）高甲醇浓度（14.4g·L-1）的诱导策略发酵88h后，上清液酶活和产率可以达到68.4U·mL-1和777U·L-1·h-1。将成熟pOPH基因连接在pET32a质粒上与硫氧还蛋白融合表达，转化E. coli BL21trxB (DE3)中。对诱导条件进行优化后，在LB培养基中不添加诱导剂IPTG，20oC下培养48h后包涵体明显减少，pOPH可溶蛋白的表达量得到明显增加，酶活达到15.7U·mL-1。（2）sOPH的纯化、结晶以及相位角解析。对毕赤酵母表达的重组sOPH酶利用疏水层析和离子交换层析的两步法进行纯化，得到了高纯度的sOPH蛋白。将sOPH蛋白浓缩至30mg·mL-1，对结晶条件反复进行筛选和优化，并最终得到了薄片形状的晶体。在同步辐射中心进行X-光衍射数据收集，得到了分辨率为1.90的高质量衍射数据。使用分子置换法、单波长反常散射法和同晶置换法解析sOPH的相位角，但是均未能成功。（3）pOPH的纯化、结晶以及相位角解析。对大肠杆菌产成熟pOPH进行纯化，利用两次亲和层析和阴离子交换层析的纯化策略，得到了纯度较高的pOPH蛋白。将高纯度的pOPH蛋白浓缩至10mg·mL-1，进行结晶条件的初筛和优化，最终得到了形状规则的晶体。在同步辐射中心进行X-光衍射实验，收到了两套分辨率较高（1.60和2.10）的晶体衍射数据。为了解析pOPH晶体数据的相位，尝试利用分子置换法、多波长反常散射法等方法，但是结果都不理想。将pOPH的活性区氨基酸Ser172突变成半胱氨酸。通过利用单波长反常散射法计算蛋白晶体浸泡K2ReCl4的重金属衍生物的衍射数据，最终得到了pOPH S172C的相位角，并解出了晶体结构。（4）pOPH和sOPH结构解析以及催化机制的讨论。利用突变体pOPHS172C的相位信息，通过分子置换法最终得到pOPH和sOPH的晶体结构。sOPH和pOPH的晶体结构具有α/β水解酶的典型特征。将pOPH以及突变体的晶体浸泡抑制剂后再进行X-光衍射实验，分别得到含有乙酰丙酮和辛酸的复合体结构。以这两组结构为基础，模拟得到了氧化型PVA与OPH的结构模型，并阐述了以Ser172为亲核反应发起者，His298和Asp253为质子传递者，Ser66与Val67，Ser173之间形成的两个“氧洞”结构来稳定反应中间体的水解反应机理，这一特点与α/β水解酶的单“氧洞”机制有所不同。（5）pOPH催化特性改造。分析pOPH以及复合体结构后，选择活性区附近的Trp255、Tyr270、Arg264和二硫键Cys257/267等关键氨基酸进行分子改造。相比于pOPH的水解反应活力（kcat/Km），突变体W255Y、Y270F和R264A分别提高了1.56、1.41和1.42倍。利用pOPH的晶体结构对突变体结果做出了解释。组合突变体W255Y/R264A和W255Y/R264A/Y270A的水解反应活力比pOPH分别提高了2.53和2.66倍。说明W255Y、R264A和Y270A三个突变点之间有一定的协同增效作用。将突变体W255Y/R264A/Y270A连接在分泌型质粒pET20b后，在优化的发酵条件下，重组大肠杆菌发酵上清液酶活达到20.9U·mL-1，产率为249U·L-1·h-1。sOPH和pOPH及其Trp255的三个突变体水解不同碳链长度的对硝基苯酚酯的动力学参数进行分析。随着底物碳链长度的加长，pOPH和sOPH水解底物的Km逐渐升高，kcat/Km逐渐降低。在pOPH/PNPB的复合体结构的分析中，水解产物的空间位阻作用可能是导致OPH酶对PNPB的低水解活性的原因。Trp255在溶剂中保护活性区有重要作用。二硫键Cys257/267的形成对于pOPH表现水解活性是非常重要的，但是对拥有较短“盖子”结构的sOPH则不是必需的。