原发性肝癌为全球常见的恶性肿瘤之一。由于肝癌的恶性程度高、预后差，肝癌居世界癌症死因的第四位。而我国由于乙型病毒性肝炎的高感染率，肝癌的发病率有增高的趋势。虽然在过去的几十年里肝癌治疗规范的得到了大家共识，但肝癌总的5年生存率总体来讲并不理想，其根本原因可能是由于残余肿瘤细胞对现有治疗手段的抵抗。近年来，肿瘤细胞中的一些特殊亚群具有干细胞特性，称之为肿瘤启始细胞或者肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs），肿瘤干细胞具有维持和促进肿瘤生长的特性。肿瘤干细胞理论的提出为肿瘤防治模式提供了全新的思路。根据肿瘤干细胞理论，肿瘤干细胞具有极强的增殖、自我更新和多向分化能力。已有研究表明，肿瘤干细胞可能是肿瘤复发、治疗抵抗的根源。因此，探索肿瘤干细胞在肿瘤发生发展过程中的作用，成为开发靶向肿瘤干细胞的治疗手段的重要研究方向。微RNA（miRNAs）是一类小的内源性非编码单链RNA，长度大约为21～23个核苷酸，它有负调控靶基因的功能。微RNA既可以起癌基因又可以起抑癌基因的作用。有研究表明，微RNA分子通过调控基因和蛋白的表达参与了维持肿瘤干细胞的表型。最近的研究表明，微RNA在肿瘤的发生、细胞增殖和多向分化等过程中发挥了重要作用。但目前对微RNA在肝癌干细胞中的表达情况仍不清楚。因此，比较肝癌干细胞和非肝癌干细胞之间的微RNA差异表达谱，对于揭示微RNA对肝癌干细胞恶性表型的调控作用有重要意义。目的：1．通过免疫磁珠法从肝癌细胞系SMMC-7721中分选CD133~+细胞，并对其肿瘤干细胞特性进行鉴定。2.比较CD133~+SMMC-7721细胞和CD133-SMMC-7721细胞之间的差异miRNAs表达谱，并对在CD133-SMMC-7721细胞中表达显著上调的miRNAs进行生物学信息分析。3.研究调控miR-150对CD133~+肝癌干细胞增殖、分化和侵袭等恶性表型的影响，并揭示其分子机制。方法：1．通过免疫磁珠法分选CD133~+SMMC-7721细胞和CD133-SMMC-7721细胞，流式细胞仪和Western blotting检测分选后细胞纯度。2．CCK-8法检测CD133~+SMMC-7721细胞增殖能力，克隆形成实验检测CD133~+SMMC-7721细胞克隆形成能力，无血清成球实验检测CD133~+SMMC-7721细胞单克隆细胞团形成能力，NOD/SCID老鼠移植瘤实验检测CD133~+SMMC-7721细胞成瘤能力。3.利用Trizol法分别抽提CD133~+SMMC-7721细胞和CD133-SMMC-7721细胞的总RNA，miRNA基因芯片检测两组细胞miRNAs差异表达谱，荧光定量PCR对感兴趣的差异miRNAs进行验证。利用三种常用的生物信息学软件（miRanda、TargetSCAN and PicTar）对表达差异显著的miRNAs进行生物信息学分析及靶基因预测。4.构建miR-150慢病毒表达载体并转染CD133~+SMMC-7721细胞and CD133-SMMC-7721细胞。通过转染miR-150慢病毒过表达载体后，检测其对CD133~+SMMC-7721细胞增殖和自我更新潜能的影响，包括细胞增殖能力、无血清成球能力、细胞周期、凋亡和细胞侵袭能力。双荧光素报告基因验证miR-150及其预测靶基因c-Myb的调控关系。结果：1、SMMC-7721细胞系中CD133~+细胞表达比例约为0.20%到2.16%，免疫磁珠分选后CD133~+细胞表达比例约为92.05±5.12%。Western blotting结果显示CD133蛋白在CD133~+SMMC-7721细胞和CD133-SMMC-7721细胞中表达水平有显著性差异（0.873±0.05vs.0.067±0.015）。2、分选得到的CD133~+SMMC-7721细胞置于含生长因子的无血清条件培养基中培养24～72h后即可形成细胞球，而CD133-SMMC-7721细胞则不能形成细胞球。当将CD133~+SMMC-7721细胞培养形成的细胞球转移到含血清的培养基后，细胞球开始贴壁生长，而且48h内细胞球就会全部贴壁。3、 CD133~+SMMC-7721细胞的增殖能力明显强于CD133-SMMC-7721细胞，而且在培养第五天时差异最明显。克隆形成实验表明CD133~+SMMC-7721细胞的克隆形成能力显著强于CD133~+SMMC-7721细胞（271.22±57vs.22.24±6.56）。4、CD133~+SMMC-7721细胞具有致瘤能力明显高于阴性细胞。接种10~3个CD133~+SMMC-7721细胞6周后可以使2只老鼠成瘤（2/5），而接种104个CD133~+SMMC-7721细胞可以使5只老鼠成瘤（5/5）.5、 miRNA基因芯片结果显示CD133~+SMMC-7721细胞和CD133-SMMC-7721细胞之间存在着差异表达的miRNA表达谱。特别在CD133~+SMMC-7721细胞存在一些表达上调的miRNA，包括hsa-miR-150, hsa-miR-152, hsa-miR-888, hsa-miR-519e, hsa-miR-532-5p.我们通过应用Realtime-PCR对这些表达上调的miRNA进行了验证。通过TargetSCAN和PicTar这两个常用的生物信息学软件检索这些表达上调的miRNA生物学功能并预测其靶基因，初步生物信息学分析表明，在这些上调的miRNA中miR-150可能是与肝癌干细胞恶性表型相关的关键分子。miR-150的预测靶基因是癌基因c-Myb，c-Myb mRNA的3’非编码区与miR-150有两个结合位点（904-910nt和968-974nt）。6、构建c-Myb基因的3’非编码区（3‘UTR）及突变的c-Myb基因的3’非编码区（3’-UTR）的双荧光素酶报告基因载体，并通过基因测序进行验证。将双荧光素酶报告基因质粒及miR-150过表达质粒共转染293T细胞，结果表明与对照组相比，共转染miR-150过表达质粒与野生型的c-Myb基因的3’非编码区可使细胞的荧光素酶活性下降约36%。双荧光素酶报告基因系统结果说明转染细胞中miR-150可通过与报告基因的3’UTR的互补位点相互作用。7、Western blotting结果表明，与转染control vectors组和空白对照组相比，转染miR-150过表达载体显著抑制c-Myb蛋白的表达（0.31±0.07vs.0.80±0.09and0.81±0.08）。RT-PCR结果表明转染miR-150过表达载体对c-Myb mRNA的表达无明显影响（0.85±0.04vs.0.81±0.03和0.80±0.09）。8、与转染control vectors组和空白对照组相比，转染miR-150过表达载体显著抑制CD133~+细胞增殖能力。流式细胞仪结果表明，转染miR-150过表达载体后细胞凋亡率约为25.21±9.26%，而转染controlvectors组及空白对照组分别为6.39±1.02%和5.87±0.74%。Transwell细胞侵袭实验表明，与对照组相比，转染miR-150过表达载体后细胞侵袭能力显著下降，miR-150组，慢病毒载体对照组及空白对照组微膜下细胞数分别为：（37.6±5.52），（109.2±22.3），（114.6±14.45）。结论：我们成功从SMMC-7721细胞株中分选得到CD133~+细胞亚群，并证明其具有某些肿瘤干细胞样细胞的特性。CD133~+SMMC-7721细胞亚群显示出较高的增殖、克隆形成、无血清成球及体内成瘤能力。miR-150在CD133~+SMMC-7721细胞亚群中显著低表达，生物信息学分析表明其可能在维持CD133~+肝癌干细胞恶性表型中起了重要作用，癌基因c-Myb可能是的miR-150调控的靶基因。过表达miR-150时，c-Myb蛋白表达水平降低，细胞增殖和成球能力减弱，细胞凋亡增加，细胞侵袭能力下降。因此，我们的研究表明miR-150通过调控其靶基因c-Myb的表达，在维持CD133~+肝癌干细胞恶性表型的分子机制中发挥了重要作用。