木霉属(Trichoderma spp.)真菌是一类广泛存在于森林、草地、农田等潮湿生境的土壤习居菌。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是木霉属中较早应用于生物防治的菌种。松树萎蔫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的会造成松属植物快速枯死的毁灭性病害。该病害现已给我国林业造成了重大损失。哈茨木霉对土壤线虫有抑制作用,但哈茨木霉对松材线虫的毒力因子则较少有人研究。本研究通过对哈茨木霉E15进行有生物学重复的松材线虫处理,并在无菌环境下对处理的菌丝样品进行了取样和转录组测序分析。通过对转录组数据的分析挖掘,找到差异表达基因。并进一步筛选出了可能与哈茨木霉抗松材线虫反应有关的枯草杆菌蛋白酶家族(peptidase S8)基因、和乙醇脱氢酶基因。后续利用生物信息学方法对上述两个家族的基因进行分析。实验主要得出以下结论:1 本次转录组测序的6个样品组共测得clean reads的条数为502953500,共得到75.45G的测序数据。转录组测序数据与哈茨木霉参考基因组的最低unique map率高于90%,表明E15菌种与参考基因组亲缘关系较近,基因注释准确度较高。基因差异表达分析一共筛选到5645条差异表达基因,其中2857条基因上调,2788条基因下调。在KEGG代谢通路富集分析中排名前10的通路为核糖体通路(tre03010)、真核生物的核糖体生物发生通路(tre03008)、氨酰基-tRNA的生物合成通路(tre00970)、RNA聚合酶通路(tre03020)、剪接体通路(tre03040)、RNA转运通路(tre03013)、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路(tre00400)、卟啉和叶绿素代谢通路(tre00860)、β-丙氨酸代谢通路(tre00410)、糖酵解/糖异生通路(tre00010)。通过GO注释的富集分析,枯草杆菌蛋白酶家族(peptidase S8)基因显著富集于蛋白质代谢过程(protein metabolic process,GO:0019538)。根据基因功能注释结果和基因差异表达分析结果,筛选出了来自枯草杆菌蛋白酶家族和乙醇脱氢酶家族的各12条显著上调表达的基因。这些基因极可能与哈茨木霉的抗线虫反应有关,后续对这些基因进行了生物信息学分析。2对筛选出的来自枯草杆菌蛋白酶家族的12条基因分别命名为ThSP1-ThSP12。构建了 8种木霉枯草杆菌蛋白酶基因系统发育树。分析结果表明ThSP1属于Peptidase S8家族 subfamily 7 亚家族(cd07491);ThSP2,ThSP3-ThSP7属于 S8 and S53 家族,但ThSP2 与ThSP3-ThSP7 分属于不同的亚家族(c110459,cd00306);ThSP8-ThSP12 属于Peptidase S8家族subfamily 5亚家族(cd07489)。氨基酸序列比对和蛋白基序分析帮助我们确定了枯草杆菌蛋白酶保守结构域的位置,并且找到了活性位点的位置。对枯草杆菌蛋白酶家族的顺式作用元件进行了预测分析,找到了可能与茉莉酸、水杨酸、低温响应和干旱诱导等有关的顺式作用元件。3对筛选出的乙醇脱氢酶家族基因命名为ADH1-ADH12。构建了三种木霉乙醇脱氢酶基因的系统发育树,结果显示ADH1、ADH2、ADH4、ADH6、ADH8、ADH9、ADH10这七条基因属于同一亚家族,而ADH3、ADH5、ADH7、ADH12则有较近的亲缘关系。氨基酸多序列比对和蛋白基序分析的结果表明每个乙醇脱氢酶单体都有两个主要结构域:催化结构域和一个辅酶结合域。通过比对我们定位到了这两个结构域的位置,并且找出了其序列中最保守的基序。利用同源建模法预测了哈茨木霉乙醇脱氢酶的三级结构,序列与预测模型一致度为68.19%。利用蛋白结构分析软件对预测的结果进行了可视化处理分析。