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乳腺癌是女性主要的恶性肿瘤之一。自杀基因疗法是基因治疗的重要策略,它通过转基因的方法将人类不具有的自杀基因导入肿瘤细胞内,其表达产物可将无毒性的药物前体转化为有毒性的代谢产物,影响细胞的生物合成,导致细胞死亡。我们利用重组腺相关病毒介导的含Tet-On调控元件的HSVtk/GCV自杀基因治疗系统对人类乳腺癌细胞株MCF-7进行杀伤性实验,结合彗星实验与Western Blotting、RT-PCR等实验技术初步研究该系统对乳腺癌细胞的DNA损伤影响及其作用的分子机理。第一章rAAV介导的含Tet-On调控元件的HSVtk/GCV自杀基因系统对乳腺癌细胞DNA的损伤影响将pAAV/TRE/Tet-On/HSVtk, pHelper和pAAV-RC三质粒通过磷酸钙共沉淀转染至病毒包装细胞HEK293T,获得了重组腺相关病毒rAAV/TRE/Tet-On/HSVtk对浓缩纯化后的rAAV,以斑点杂交的方法检测并计算rAAV的物理滴度为2.0xl011/ml。以rAAV/TRE/Tet-On/HSVtk、Dox和GCV处理乳腺癌细胞,实验分为rAAV+Dox+GCV组、rAAV+Dox组、rAAV+GCV组、rAAV组及阴性对照组。彗星实验检测自杀基因治疗系统对该细胞DNA损伤的影响,结果显示,药物处理细胞48h后,rAAV+Dox+GCV组的细胞相对其他各组,细胞有明显的彗星拖尾现象。通过统计分析彗尾面积百分率和彗矩检测HSVtk自杀基因系统处理细胞前后造成的DNA损伤程度,结果发现,rAAV+Dox+GCV组的细胞相对其他各组,其DNA迁移程度明显增大(P<0.05),表明该系统干预乳腺癌细胞后,会导致细胞DNA损伤水平的提高。第二章rAAV介导的含Tet-On调控元件的HSVtk/GCV自杀基因系统对乳腺癌细胞DNA损伤反应的分子机制的初步研究本课题组前期用基因芯片技术检测了自杀基因治疗系统HSVtk/GCV对乳腺癌细胞内基因表达谱的影响,结果显示,rAAV+Dox+GCV组细胞与其他各组相比：246个上调基因,64个下调基因,与DNA复制、DNA损伤与修复相关的基因比较多,还包括很多锌指结构蛋白。结合此结果,选取DNA损伤反应相关的活性基因进行RT-PCR实验。RT-PCR验证了ATM、p53、p27、CyclinE与CDK2在rAAV+Dox+GCV处理组与各对照组细胞之间的表达水平,结果显示ATM, p53与p27表达显著上调,而CyclinE与CDK2则没有表达差异。利用Western Blotting研究自杀基因治疗系统干预后细胞DNA损伤后相关蛋白ATMs、p53s、p27、CyclinE与CDK2的表达水平。实验结果显示,与其他各组相比,rAAV+Dox+GCV处理组的ATM、p53及p27蛋白表达水平上调,而CyclinE与CDK2的表达水平没有明显变化。我们推测,HSVtk/GCV自杀基因治疗系统对乳腺癌细胞MCF-7的DNA损伤作用可能是通过一种p53依赖性的信号通路上调p27的表达,进而导致CyclinE-CDK2复合物在细胞周期调控中的活性降低,并引起细胞周期阻滞,最终杀死乳腺癌细胞。