Ⅱ型分子伴侣广泛存在于古细菌和真核生物胞液中，他们能够在体内外促进蛋白质多肽链的正确折叠，有效地抑制变性蛋白质的聚集，具有重要作用。 硫矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）P2是一种典型的泉古菌门硫化叶菌属嗜热古菌，具有良好的耐高温性能，但其分子伴侣研究在国际上未见报道，本实验室首次报道克隆表达了该菌分子伴侣基因并证实了其分子伴侣是由不同的亚基组成的8元旋转对称双环结构，具有分子伴侣功能功能[6]，发现该分子伴侣具有明显ATPase活性。但ATP对古菌P2分子伴侣功能影响至今未见任何报道。 本研究以硫矿硫化叶菌P2β分子伴侣为研究对象，通过与其他Ⅱ型分子伴侣序列的保守性比对及空间结构寻找与ATPase活性有关的位点，利用重叠延伸PCR技术成功构建P2分子伴侣基因定点突变，将该分子伴侣的Asp104突变成Arg104，Ala418突变为Thr，并将这个突变基因在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了高效表达，获得ATPase活性变化的分子伴侣突变体。在此基础上，对突变分子伴侣蛋白的性质与功能进行进一步的研究。 硫矿硫化叶菌P2分子伴侣突变表达工程菌，经IPTG诱导表达后，所收集的菌体用超声波破碎。破碎后的上清经75℃高温处理30 min去除大量杂蛋白，再经80%饱和度的（NH4）2S04盐析以及Resouce Q离子柱层析纯化后，得到了突变分子伴侣的单体。纯化后的分子伴侣单体，在ATP和Mg2+存在的条件下经过5h可聚合成典型的双层面包圈结构的分子伴侣八聚体。利用孔雀石绿方法，在不同温度下对两个突变体进行分子伴侣ATPase测定，结果表明一个突变体ATPase活性丧失，另一个ATPase活性增加，可见我们设计的基因突变位点确实与ATPase活性有关。以绿色荧光蛋白（GFP）为研究对象，分析P2分子伴侣野生型及突变型对酸变性蛋白重新折叠的促进作用，结果发现该分子伴侣ATPase活性增加的突变体对外源GFP的复性与野生型相比具有更为明显的促进作用，而ATPase活性丧失的突变体则不能促进GFP的折叠。以柠檬酸合酶为研究对象，分析该P2分子伴侣对外源蛋白热聚集的影响，结果发现该分子伴侣防止外源蛋白聚集的作用与ATPase有关。 本研究表明：硫矿硫化叶菌P2分子伴侣104位的天冬氨酸和418位的丙氨酸是影响该型古菌分子伴侣对ATP结合和水解能力的关键位点，它们的突变可以引起ATPase活性的变化。在失去ATPase活性后，P2分子伴侣同时也失去了介导变性荧光蛋白GFP重新折叠复性的能力；同时也不再具有提高柠檬酸合酶抗热聚集的能力。而ATPase活性增加的分子伴侣突变体可以更好的促进变性蛋白的复性和防止蛋白的热聚集，足以说明古菌P2β分子伴侣在行使分子伴侣功能时需要ATP水解提供能量，为进一步研究Ⅱ型分子伴侣的作用过程和机制奠定了良好的基础。