研究背景与目的:前列腺癌(PCa)作为男性特有的泌尿生殖系肿瘤,其发病率已居于全球男性肿瘤发病率前列。在2018年统计的全球男性新发癌症中,前列腺癌居于第2位,发病率为13.5%,在全球男性癌症病死率中居于第5位(6.7%)。此外,在美国公布的2019年男性新发癌症中,前列腺癌发病率已超越肺癌,居于第1位,癌症病死率在男性癌症中居于第2位[1]。前列腺癌日益成为危及全球男性健康的头号杀手。肿瘤的发生、发展、侵袭及转移是一个非常复杂的过程。尽管近些年随着对前列腺癌研究的不断深入,对前列腺癌的发生、发展、侵袭和转移的基因及表观遗传方面有了更深一步认识,但直到目前为止,前列腺癌发生发展中的核心功能基因及其相关分子机制尚不明确。随着新一代基因组测序的普及以及单细胞测序技术的发展,使快速高通量发现肿瘤突变基因及融合基因成为可能,并日渐成为常用的肿瘤研究手段[2]。但由于测序的高通量大数据性注定使这些研究手段会产生大量的冗杂信息。如何更好地摒弃冗杂信息从而挑选并进行关键基因及表观水平研究,就显得尤为重要。CRISPR-Cas9基因编辑技术自面世起就越来越受到科研工作者的关注,并在其基础上发展出一系列衍生技术,使高效可靠的基因干预技术成为现实[3]。自2015年在CRISPR-Cas9基因编辑技术的基础上延伸出来的CRISPR文库筛选策略的发现及应用,使基因功能的筛选和验证可以实现通量化[4]。但目前并没有专门针对前列腺癌的特异高频突变基因,尤其是融合基因母基因的CRISPR文库筛选,使得真正对前列腺癌有意义的基因没有更好的被聚焦从而使大量的关键基因被忽略[5]。UBXN4又名Erasin,最初被发现通过自身UBX结构域与VCP/P97相互作用从而参与细胞内质网相关蛋白降解(ERAD)这一过程[6]。尽管有文献报道含UBX结构域蛋白家族参与肿瘤发生及进展,然而UBXN4在肿瘤中作用并未有太多报道。肿瘤及肿瘤微环境之间的相互作用对于肿瘤的发生发展及演化都至关重要。肿瘤微环境对肿瘤细胞的影响主要包括两大类:一类是生物化学信号,另一类则是微环境中的机械物理信号。对于微环境中的生物化学信号,既往研究已经很多。但是对于机械物理信号,如肿瘤细胞如何响应微环境中各组织机械硬度等方面知之甚少[7]。本课题的主要通过从临床样本进行新一代测序的基础上联合CRISPR文库筛选策略,针对测序所得的高频突变基因及融合基因进行高通量基因功能验证。根据增殖迁移表型,筛选出增殖优势克隆,最终聚焦的优势克隆株为基因UBXN4失活突变株。并进一步在体内及体外验证基因UBXN4突变对前列腺癌细胞系增殖迁移表型的影响,并希冀在此基础上解析UBXN4除了参与ERAD之外其他更深层次的抗肿瘤机制。由于本实验涉及四种不同转移部位来源的前列腺癌细胞系,并且其组织来源处微环境中机械物理性质差异极大,本论文还初步探索了前列腺癌不同转移部位的细胞系在不同的机械硬度衬底上进行培养,并比较不同细胞系在体外培养过程中可能发生的良恶性转变倾向性,在此基础上阐述PC3及LNCap细胞系对体外培养中软硬衬底等机械环境响应的异质性。第一部分UBXN4基因在前列腺癌发生发展中作用及其机制研究方法:1.在前列腺癌及癌旁组织新一代测序基础上,针对高频突变基因及融合基因构建CRISPR文库进行功能基因筛选并挑选增殖优势细胞克隆(命名Clone6)。2.Clone6增殖迁移成瘤表型实验,然后进行Clone6细胞sg RNA鉴定,并最终确定突变基因(UBXN4)。3.利用小干扰RNA转染前列腺癌细胞系(DU145、LNCa P、PC3和C42B),并以si NC为对照,明确基因UBXN4对前列腺癌细胞系增殖抑制作用。4.在DU145细胞系中,针对基因UBXN4另一外显子再次构建CRISPR-Cas9基因编辑体系,筛选出稳定突变细胞系(DU145-KOUBXN4-mix),并进行增殖迁移表型鉴定。5.构建UBXN4过表达病毒,在WT-DU145中过表达UBXN4并进行增殖表型鉴定。在UBXN4敲除DU145细胞株中进行过表达补救实验。6.在进行免疫共沉淀联合质谱分析的基础上,预测基因UBXN4发挥抑癌作用的调控机制。结果:1.在65对前列腺癌及癌旁组织高通量测序,针对每条高频突变基因及融合基因母基因特异性的sg RNA并进行病毒包装,组成CRISPR慢病毒文库。在前列腺癌细胞系DU145中转染文库,药物筛选后感染合适浓度Cas9病毒。筛选出增殖优势明显的细胞群落为优势克隆群(命名为Clone6)。2.与野生DU145相比较,Clone6组细胞具有更强的增殖迁移及成瘤能力。对Clone6组细胞进行sg RNA骨架测序、基因组PCR及测序及Western Blot实验,均可指示优势克隆Clone6细胞内进入的sg RNA是靶向基因UBXN4第2外显子进而造成基因UBXN4突变。3.对基因UBXN4设计小干扰RNA(si-UBXN4-1、2、3),并对细胞系DU145、LNCa P、PC3和C4-2B进行小干扰RNA转染,以si NC为对照,然后对细胞行CCK8增殖实验、Ed U增殖实验、Transwell迁移实验及划痕实验。结果显示,相比较于si NC组,si-UBXN4组表现出更强的增殖迁移能力。4.针对基因UBXN4第12外显子再次构建CRISPR-Cas9基因编辑体系,基因水平突变位点测序及蛋白水平Western Blot验证DU145人为基因UBXN4突变成功,命名为DU145-KOUBXN4-mix,并挑选单克隆细胞株命名为DU145-KOUBXN4-1。然后对细胞DU145-KOUBXN4-mix及DU145-KOUBXN4-1行增殖迁移表型实验。结果显示,相比较于野生DU145组,DU145-KOUBXN4-mix及DU145-KOUBXN4-1组表现出更强的增殖迁移能力。5.构建UBXN4过表达质粒并进行过表达病毒包装,对野生DU145进行过表达病毒感染,嘌呤霉素进行筛选后行RT-PCR及Western Blot实验进行过表达效率验证,并进行CCK8增殖实验及Ed U增殖实验。结果显示,相比于野生DU145组,过表达UBXN4组均表现出较慢的的增殖趋势。在Clone6及DU145-KOUBXN4-mix及DU145-KOUBXN4-1细胞株上进行过表达补救实验。结果发现,UBXN4的过表达抑制了UBXN4突变所导致的促增殖作用。6.在对野生DU145上用UBXN4的抗体进行免疫共沉淀联合质谱分析过程中,发现蛋白UBXN4可以和铁死亡相关蛋白(TFRC及SLC3A2)及蛋白Rab10结合,后期将进行铁死亡相关实验进行验证。结论:通过已有结果可以得出,在新一代测序的基础上联合CRISPR文库筛选到基因UBXN4的突变可以导致前列腺癌细胞系增殖迁移能力增加,表现出更强的恶性转化,提示UBXN4是一个很强的肿瘤抑制基因。接下来的小干扰RNA设计及转染,过表达UBXN4病毒包装及感染以及对基因UBXN4不同位点重新人为突变等措施,增殖迁移实验结果均表现出UBXN4表达量降低会促进前列腺癌细胞增殖迁移能力,过表达UBXN4会抑制前列腺癌细胞增殖迁移能力。过表达UBXN4补救实验可以缓解UBXN4突变导致的恶性转化。种种迹象表明,基因UBXN4可以作为一个强力肿瘤抑制基因,从而对基因UBXN4有了一个更深层次的认识,对于基因突变与前列腺癌恶性转化之间的关系也有个更深层次的了解,对于未来前列腺癌的基因诊断和治疗提供重要参考。第二部分不同前列腺癌细胞系对外界机械力响应的异质性研究方法:1.根据已有文献,进行不同硬度细胞培养PDMS衬底的制备及物理硬度表征。2.在不同软硬衬底上培养前列腺癌细胞系(PC3、LNCa P、DU145及C42B),并对不同细胞系的恶性表型如增殖、迁移进行检测,以探索不同硬度衬底对肿瘤细胞的影响。3.对PC3及LNCa P在不同机械硬度的衬底上进行培养7天后进行裸鼠皮下荷瘤实验以探索不同硬度衬底培养对肿瘤细胞系成瘤能力影响。4.基于上一步实验结果及结合以往文献,对硬性衬底上表现出恶性表型增强的PC3细胞进行YAP/TAZ入核验证,以鉴定硬性衬底促进YAP/TAZ的核定位,以促进PC3细胞的增殖和迁移。结果:1.根据已有文献方法配制两种细胞培养衬底,硬度分别为46.7KPa和0.7KPa以模仿生物体内骨和淋巴结的生理硬度,并在两种硬度衬底上分别进行细胞培养。2.以四种前列腺癌细胞系(前列腺癌骨转移细胞系PC3、前列腺癌淋巴结转移细胞系LNCa P、前列腺癌脑转移细胞系DU145以及LNCa P骨转移细胞系C4-2B)进行下述研究。Ed U细胞增殖实验及Transwell细胞侵袭实验测结果显示,PC3细胞系在硬性衬底上表现出更强的增殖和侵袭能力,LNCa P细胞系在软衬底上表现出更强的增殖和侵袭能力。3.将PC3和LNCa P细胞系在不同硬度衬底上培养7天后,进行裸鼠皮下荷瘤实验,结果显示,PC3细胞系在硬性衬底上表现出更强的体内成瘤能力,LNCa P细胞系在软衬底上表现出更强的体外成瘤能力。4.针对硬衬底上PC3细胞增殖、侵袭及成瘤能力增强,检测硬衬底机械力学响应关键通路YAP/TAZ通路激活情况。免疫荧光结果显示,相对于LNCa P细胞,PC3细胞在硬衬底上表现出明显的YAP核定位,而在软衬底上并没有此现象出现。Western Blotting结果显示,在同为硬性衬底上培养的PC3和LNCa P细胞中,只有PC3细胞出现了YAP1的去磷酸化,提示其具有YAP的核移位。运用YAP/TAZ小干扰RNA转染后,对硬性衬底条件下的PC3细胞进行Ed U、侵袭及荷瘤实验。结果显示,相比较于对照组,转染小干扰RNA组的肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力及体内成瘤能力明显下降。综上,提示细胞的机械力学响应明星通路YAP/TAZ参与了PC3细胞在硬衬底上增强的恶性表型改变。结论:通过已有结果显示,前列腺癌不同转移部位来源的肿瘤细胞系在不同的硬度的衬底上的生长状态不一。前列腺癌骨转移的细胞系PC3在硬性衬底上具有更强的增殖、侵袭及成瘤能力,并且这种恶性增强的获得与YAP/TAZ通路及YAP的去磷酸化入核过程密切相关。此外,前列腺癌淋巴结转移的细胞系LNCa P在软性沉底上表现出更强的增殖、侵袭及转移能力。小结:新一代测序联合CRISPR文库筛选为大规模有效发现及验证肿瘤发生发展中大量突变基因及融合基因提供了很好的思路。在此基础上发现前列腺癌高频突变基因UBXN4,基因UBXN4的突变可以增强前列腺癌细胞增殖、迁移及成瘤能力,提示基因UBXN4是一个新的抑癌基因,这一发现也揭示了UBXN4除了参与内质网相关蛋白降解(ERAD)之外的新的功能。本课题验证了二代测序联合CRISPR文库筛选的思路的正确性,并且发现了新型的抑癌基因UBXN4,这对于前列腺癌基因诊断及恶性鉴别提供更可靠的依据。肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用除了最常为研究者所关注的生物化学信号之外,还存在着机械物理信号。本研究实验表明,不同转移部位来源的前列腺癌细胞系在具有不同机械硬度衬底的培养体系中,表现出不同的增殖侵袭和成瘤能力,表明不同前列腺癌细胞系在对细胞外机械物理信号的响应具有异质性。这种响应的异质性,也进一步为理解肿瘤的亲器官转移提供更加开阔的思路,即肿瘤亲器官转移现象下除了一系列的生物化学信号发生外还存在一系列的机械物理信号的存在。