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目的：
探讨瞬时感受器电位离子通道香草素受体4(Transient receptor potential cation channel,subfamilyV4,TRPV4)及其下游钙调磷酸(Calcineurin,CaN)/活化T细胞核因子家族3(Nuclear factor activated T cells3,NFATc3)信号通路在LPS导致急性肺损伤（Acutelung injury,ALI）中的作用。
方法：
试验共分为4部分。
一、CaN/NFATc3信号通路在LPS诱导巨噬细胞炎症中的作用
使用小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7细胞作为研究对象。采用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）（100ng/ml）刺激RAW264.7细胞建立炎症反应模型。分别予以两种CaN特异性抑制剂环孢菌素（cyclosporine A，CSA）和FK506，观察其对LPS诱导巨噬细胞炎症反应的影响。采用酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunoabsorbentassay,ELISA)法测定细胞上清中肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）及白细胞介素-6（Interleukin6,IL-6）浓度；酶标仪检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量；CaN测试盒检测细胞内CaN活性；蛋白质印迹法（Wstern bolt）法分别测定细胞胞质及细胞核中NFATc3蛋白的表达。
二、胞外Ca2+浓度对LPS诱导巨噬细胞炎症及CaN/NFATc3信号通路的影响
采用LPS（100ng/ml）刺激RAW264.7细胞建立炎症反应模型。分别予以EDTA螯合细胞外Ca2+或予以外源性Ca2+改变细胞外Ca2+浓度。采用ELISA法检测细胞上清中TNF-α及IL-6浓度；酶标仪检测细胞内ROS含量；钙离子荧光探针测细胞内Ca2+浓度；CaN测试盒检测细胞内CaN活性；Wstern bolt法分别测定细胞质及细胞核中NFATc3蛋白的表达。
三、TRPV4敲除对LPS诱导巨噬细胞炎症及CaN/NFATc3信号通路的影响
siRNA沉默TRPV4表达，并构建LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应模型。LPS处理后，采用ELISA法检测细胞上清中TNF-α及IL-6浓度；酶标仪检测细胞内ROS含量；钙离子探针测细胞内Ca2+浓度；CaN测试盒检测细胞内CaN活性；Wstern bolt法分别测定细胞质及细胞核中NFATc3蛋白的表达。
四、TRPV4药理抑制剂对LPS致小鼠急性肺损伤影响的研究。
选择SPF级雄性C57BL/6小鼠，腹腔注射LPS（10mg/kg）建立小鼠ALI模型。分别予以Gsk2193874和HC067047，抑制TRPV4激活。LPS处理24h后，处死小鼠。取肺组织行HE染色，行肺损伤评分；收集支气管肺泡灌洗液(BALF)检测TNF-α及IL-6浓度，总蛋白浓度，细胞总数及中性粒细胞数；取肺组织测量肺组织湿干重比(Wet to Dry ratio,W/D)。
结果：
1.予以CSA及FK-506处理后，可以减轻LPS导致的RAW264.7细胞上清液中TNF-α及IL-6释放，降低细胞中ROS水平及CaN活性(P＜0.05)；也可以抑制细胞质中NFATc3向细胞核转移(P＜0.05)。
2.EDTA螯合细胞外Ca2+可以显著减轻LPS刺激的RAW264.7细胞TNF-α及IL-6释放，并降低细胞中ROS水平、Ca2+浓度及CaN活性（P＜0.05)；还可以抑制细胞质中NFATc3向核内转移(P＜0.05)；予以外源性Ca2+后，可以加重LPS刺激的RAW264.7细胞TNF-α及IL-6释放，升高细胞中ROS水平、Ca2+浓度及CaN活性显，并显著促进细胞质中NFATc3向细胞核转移(P＜0.05)。
3.下调RAW264.7细胞TRPV4表达，可以显著减轻LPS导致的RAW264.7细胞上清液中TNF-α及IL-6释放；降低细胞中ROS水平、Ca2+浓度及CaN活性(P＜0.05)；抑制细胞质中NFATc3向核内转移(P＜0.05)。
4.TRPV4抑制剂GSK2193874及HC06704都可以改善LPS导致的肺损伤程度，降低肺组织W/D比值；也可以显著降低BALF中总蛋白浓度、TNF-α和IL-6浓度以及中性粒细胞数目（P＜0.05）。
结论：
TRPV4及其调控的Ca2+内流可以通过激活CaN/NFATc3信号通路介导LPS导致ALI的发生发展。
探讨瞬时感受器电位离子通道香草素受体4(Transient receptor potential cation channel,subfamilyV4,TRPV4)及其下游钙调磷酸(Calcineurin,CaN)/活化T细胞核因子家族3(Nuclear factor activated T cells3,NFATc3)信号通路在LPS导致急性肺损伤（Acutelung injury,ALI）中的作用。
方法：
试验共分为4部分。
一、CaN/NFATc3信号通路在LPS诱导巨噬细胞炎症中的作用
使用小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7细胞作为研究对象。采用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）（100ng/ml）刺激RAW264.7细胞建立炎症反应模型。分别予以两种CaN特异性抑制剂环孢菌素（cyclosporine A，CSA）和FK506，观察其对LPS诱导巨噬细胞炎症反应的影响。采用酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunoabsorbentassay,ELISA)法测定细胞上清中肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）及白细胞介素-6（Interleukin6,IL-6）浓度；酶标仪检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量；CaN测试盒检测细胞内CaN活性；蛋白质印迹法（Wstern bolt）法分别测定细胞胞质及细胞核中NFATc3蛋白的表达。
二、胞外Ca2+浓度对LPS诱导巨噬细胞炎症及CaN/NFATc3信号通路的影响
采用LPS（100ng/ml）刺激RAW264.7细胞建立炎症反应模型。分别予以EDTA螯合细胞外Ca2+或予以外源性Ca2+改变细胞外Ca2+浓度。采用ELISA法检测细胞上清中TNF-α及IL-6浓度；酶标仪检测细胞内ROS含量；钙离子荧光探针测细胞内Ca2+浓度；CaN测试盒检测细胞内CaN活性；Wstern bolt法分别测定细胞质及细胞核中NFATc3蛋白的表达。
三、TRPV4敲除对LPS诱导巨噬细胞炎症及CaN/NFATc3信号通路的影响
siRNA沉默TRPV4表达，并构建LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应模型。LPS处理后，采用ELISA法检测细胞上清中TNF-α及IL-6浓度；酶标仪检测细胞内ROS含量；钙离子探针测细胞内Ca2+浓度；CaN测试盒检测细胞内CaN活性；Wstern bolt法分别测定细胞质及细胞核中NFATc3蛋白的表达。
四、TRPV4药理抑制剂对LPS致小鼠急性肺损伤影响的研究。
选择SPF级雄性C57BL/6小鼠，腹腔注射LPS（10mg/kg）建立小鼠ALI模型。分别予以Gsk2193874和HC067047，抑制TRPV4激活。LPS处理24h后，处死小鼠。取肺组织行HE染色，行肺损伤评分；收集支气管肺泡灌洗液(BALF)检测TNF-α及IL-6浓度，总蛋白浓度，细胞总数及中性粒细胞数；取肺组织测量肺组织湿干重比(Wet to Dry ratio,W/D)。
结果：
1.予以CSA及FK-506处理后，可以减轻LPS导致的RAW264.7细胞上清液中TNF-α及IL-6释放，降低细胞中ROS水平及CaN活性(P＜0.05)；也可以抑制细胞质中NFATc3向细胞核转移(P＜0.05)。
2.EDTA螯合细胞外Ca2+可以显著减轻LPS刺激的RAW264.7细胞TNF-α及IL-6释放，并降低细胞中ROS水平、Ca2+浓度及CaN活性（P＜0.05)；还可以抑制细胞质中NFATc3向核内转移(P＜0.05)；予以外源性Ca2+后，可以加重LPS刺激的RAW264.7细胞TNF-α及IL-6释放，升高细胞中ROS水平、Ca2+浓度及CaN活性显，并显著促进细胞质中NFATc3向细胞核转移(P＜0.05)。
3.下调RAW264.7细胞TRPV4表达，可以显著减轻LPS导致的RAW264.7细胞上清液中TNF-α及IL-6释放；降低细胞中ROS水平、Ca2+浓度及CaN活性(P＜0.05)；抑制细胞质中NFATc3向核内转移(P＜0.05)。
4.TRPV4抑制剂GSK2193874及HC06704都可以改善LPS导致的肺损伤程度，降低肺组织W/D比值；也可以显著降低BALF中总蛋白浓度、TNF-α和IL-6浓度以及中性粒细胞数目（P＜0.05）。
结论：
TRPV4及其调控的Ca2+内流可以通过激活CaN/NFATc3信号通路介导LPS导致ALI的发生发展。