研究背景骨缺损的治疗一直是临床骨科医师所面临的一项难题,创伤、肿瘤切除以及感染等多种原因均可导致骨缺损。较小的骨缺损机体能自行修复,若骨缺损较大则难以完成自行修复。自体骨移植以及同种异体骨移植是最为常用的治疗骨缺损的方法。但是它们仍存在一些问题,自体植骨的应用受限于供区骨量有限、增加手术风险及延长手术时间等。而同种异体骨移植可能会引起机体排异反应、疾病传播和骨不愈合等并发症,这也使异体骨移植的临床应用受到限制。目前,组织工程技术的开展可能会成为解决这一难题的有效方法。通常来说,骨组织工程主要包括三大要素,即：种子细胞、支架材料和生物活性因子。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesechymal stem cell, MSCs)是构建组织工程骨较为理想、应用最为广泛的种子细胞,因为其容易获取,并且在一定条件下可成功分化为骨、肌肉、软骨、脂肪、纤维等组织。多项研究报道,MSCs的最终分化方向主要取决于其所处的微环境,骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)是一组能诱导骨组织形成的蛋白质,可诱导MSCs向成骨细胞分化,BMP-2是BMP家族中公认的成骨能力最强的生长因子,具有强大的骨诱导能力和促进干细胞分化成骨的能力。因此外源性BMP-2蛋白或BMP-2基因常用来作为促进MSCs成骨分化的强有力手段,比如,可通过在体外将BMP-2基因转染MSCs,使其表达BMP-2蛋白,以此来促进MSCs的成骨分化。支架材料的选择也是构建组织工程骨的关键环节,目前已报道的有聚乳酸(PLA),聚乳酸与聚乙酸共聚物(PLGA),藻酸盐及β-TCP等多种支架材料。已有研究报道,三维多孔的支架材料能够促进骨再生以及种子细胞的贴附、生长与分化。三维多孔的纳米-羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)支架材料就是一种良好的种子细胞载体,因为其无论在组成成分上还是微观结构上,都具有与天然骨组织相似的特征。本研究中,我们通过电转将BMP-2基因转入MSCs,使其表达BMP-2蛋白,然后将其与纳米-羟基磷灰石/胶原/聚乳酸(nHAC/PLA)体外复合,观察BMP-2基因转染的MSCs在nHAC/PLA支架材料上的贴附、生长、增殖及分化特性。另外,将这种构建的组织工程骨植入兔自体桡骨15mm节段性骨缺损,探讨其修复骨缺损的可行性。目的1.探索兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养方法,观察其体外增殖能力及生物学特性,对MSCs句成骨细胞及成脂肪细胞方向诱导,观察其多向分化潜能,为MSCs的进一步研究奠定基础。2.研究MSCs经BMP-2基因转染后的转染效率,以及转染后目的基因的表达和成骨能力变化。3.将BMP-2基因转染的MSCs体外复合nHAC/PLA支架材料,探讨nHAC/PLA支架材料对BMP-2基因转染的MSCs的生物相容性,以及细胞在支架材料上的贴附、生长、增殖及成骨分化情况。4.将BMP-2基因转染的MSCs与nHAC/PLA支架材料复合构建的组织工程骨植入兔自体桡骨15mm节段性骨缺损,观察其体内成骨情况及修复骨缺损的效果。方法1.选取3月龄健康新西兰大白兔,穿刺抽取股骨及胫骨骨髓,密度梯度离心法分离出骨髓MSCs,相差显微镜下观察细胞的生物学特性。取生长状态良好的第2代骨髓MSCs,分别用成骨诱导培养基和成脂诱导培养基对其进行诱导分化,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色检测骨髓MSCs向成骨细胞分化的能力,通过油红O染色检测其向脂肪细胞分化的能力。2.传代培养的骨髓MSCs,以质粒为载体,通过电穿孔方法转染BMP-2基因,转染后的细胞进行如下鉴定：荧光显微镜观测绿色荧光蛋白的表达情况,计算转染效率；采用RT-PCR检测转染细胞的BMP-2 mRNA表达；采用Western blot检测BMP-2在蛋白水平的表达；行ALP定量检测以评价其成骨性能。3. BMP-2转染及空白转染的MSCs分别与nHAC/PLA支架材料进行体外复合,通过MTT检测和扫描电镜评估细胞在nHAC/PLA支架材料上的的贴附、生长与增殖情况,确定支架材料对转染细胞的生物相容性。通过测定支架材料上MSCs的ALP活性来检测其在支架材料上的成骨性能。4.建立兔桡骨15mm节段性骨缺损模型,用自体细胞行骨缺损修复,分别植入BMP-2转染的MSCs/nHAC/PLA复合体(A组)、空白转染的MSCs/nHAC/PLA复合体(B组)、单纯nHAC/PLA支架材料(C组),同时设立空白对照(D组),分别于术后第8周和第12周行X线检测和组织学观察。结果1.兔原代骨髓MSCs呈集落样生长,细胞形态呈梭形,传代后细胞生长迅速,形态较为均一,大部分细胞呈成纤维样,少部分细胞呈多角形。成骨诱导骨髓MSCs 2周后,ALP染色结果阳性,细胞呈集落生长后开始形成钙结节,茜素红染色阳性。成脂诱导3周后,油红O染色可检测到细胞质中脂滴的形成。2. BMP-2转染MSCs后,根据荧光显微镜下观察绿色荧光细胞的百分数来计算转染效率,显示平均转染效率为35.5±3.8%。RT-PCR检测证实BMP-2 mRNA表达阳性,Western blot检测证实BMP-2蛋白表达阳性。BMP-2转染的MSCs的ALP活性显著高于空白转染的MSCs。3.扫描电镜观察可见nHAC/PLA支架材料呈三维多孔状,孔隙率在75%以上。BMP-2转染及空白转染的MSCs复合nHAC/PLA支架材料后,细胞能良好的贴附并增殖。细胞接种后2小时,即可观察到BMP-2转染的MSCs在支架材料上贴附、伸展。接种后1天,可观察到细胞均扁平样铺展开,部分细胞长入孔内或跨孔生长。随着培养时间的延长,支架材料上的细胞数量逐渐增多。ALP定量检测结果表明,在细胞与支架材料复合后第3天和第7天,BMP-2转染的MSCs的ALP活性显著高于空白转染的MSCs。4、动物体内实验：X线检查：术后第8周,A组(BMP-2转染的MSCs/nHAC/PLA)的骨缺损处可见有大量骨痂形成,B组(空白转染的MSCs/nHAC/PLA)的骨缺损处可见有云雾状高密度影,但未将骨缺损处连接。术后第12周,A组的骨缺损全部愈合,骨缺损处至少有90%的区域可见骨组织,并且髓腔再通。B组的骨缺损处可见骨密度较nHAC/PLA支架材料有明显增高,却明显低于A组,但是骨缺损两端的骨折线还可观察到,骨连续性未恢复。术后第8周和第12周,C组(单纯nHAC/PLA)骨缺损处仅可见nHAC/PLA支架材料影。术后第8周和第12周,D组(空白对照)骨缺损未见有新生骨组织长入。此外,术后第8周及第12周骨缺损愈合的Lane-Sandhu X线评分显示,A组评分显著高于B组(p<0.05)。组织学检查：术后第8周A组骨缺损处可见在nHAC/PLA支架材料的孔内有小梁骨形成,小梁骨周围为正在形成的新生骨组织,在小梁骨中可见骨细胞散在分布于骨基质中,并可见成骨细胞呈线条状分布在小梁骨的边缘。B组的骨缺损可见在nHAC/PLA支架材料的孔内有大量疏松结缔组织,只在部分孔中见有少量新生骨形成。术后第12周,A组骨缺损处可见大量小梁骨生成,在部分区域可见骨髓样组织分布于小梁骨之间,髓腔部分再通,并且可在髓腔中观察到分布于骨髓组织中的正在降解的团块样的nHAC/PLA支架材料。B组骨缺损处可见较多小梁骨形成,小梁骨的周围可见大量正在形成的新生骨组织。术后第8周和第12周,C组骨缺损处有大量结缔组织及炎性细胞浸润,无新生骨组织生成。此外,术后第8周和第12周,A组成骨面积比例均显著高于B组(p<0.05)。结论1.骨髓MSCs取材方便,培养性能稳定,便于传代扩增,具有多向分化潜能,条件培养基下可成功向脂肪细胞或成骨细胞分化,是较为理想的组织工程种子细胞。2. BMP-2基因可成功转染MSCs,能够成功表达BMP-2蛋白,成骨能力明显,为后续BMP-2基因治疗的应用研究奠定了基础。3. nHAC/PLA支架材料具有适宜的三维多孔结构,BMP-2基因转染的MSCs与之复合培养表明有良好的细胞相容性,可作为基因骨组织工程的支架材料。4.以nHAC/PLA为支架,以BMP-2基因转染的MSCs为种子细胞体外构建的组织工程化骨可有效促进兔自体桡骨缺损的修复。分析其可能的机制为：转染BMP-2的MSCs通过自分泌和旁分泌的形式生成BMP-2蛋白,可诱导植入的MSCs和宿主自身的MSCs向成骨细胞分化,而成骨分化的细胞进一步释放BMP蛋白更加提高了骨修复的效果。