背景与目的尖锐湿疣(Condyloma acuminatum,CA)又称生殖器疣或性病疣,主要表现为皮肤和粘膜的良性新生物。尖锐湿疣(CA)是我国重点防治的性传播性疾病(Sexually Transmitted Disease,STD)之一,在我国发病人数逐年上升,发病率在性传播疾病(STD)中持续位居第二位。人乳头状瘤病毒(humanpapilloma viruses,HPV)是引起尖锐湿疣的病原体。人乳头瘤病毒(HPV)属乳多空病毒科(Papivaviridae)的乳头瘤病毒,是微小的DNA病毒。人体皮肤及粘膜的复层鳞状上皮为HPV的唯一宿主,目前动物模型上还不能大量培养增殖。HPV根据致病力大小,分低危、高危型。高危型有16、18等,主要导致高度子宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的发生。低危型有6、11等,主要引起生殖道、肛门周围皮肤等生殖器疣类疾病和低度子宫颈上皮内瘤变。引起尖锐湿疣的HPV型别:主要是HPV6、11;其次是HPV16、18、30、42、43、44、45、51、54、55、70等型别。HPV在温暖潮湿的环境中容易生存和增殖,因此男女的外生殖器是最易感染的部位。尖锐湿疣患者中约65%与性接触有关,其中约有一半的患者同时合并有其他性传播疾病。一般来讲,尖锐湿疣的发生在很大程度上取决于HPV感染的数量和机体的免疫状态。尖锐湿疣中绝大多数HPV感染为亚临床和无症状表现,目前所发现的只是出现临床症状即发现菜花样或疣样赘生物的患者,而绝大多数亚临床和无症状表现的HPV感染者则易被忽视。机体免疫一般分为天然免疫和获得性免疫。天然免疫在一定程度上起着较获得性免疫更为重要的作用。天然免疫具有起效短,速度快,可以在启动发挥作用的同时及其后,通过合成、诱发更多的炎症因子和细胞因子释放,从而影响获得性免疫作用的多个方面。Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)是广泛分布在免疫细胞特别是非特异免疫细胞及某些体细胞表面的一类模式识别受体,可以通过识别和结合病原相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMPs)发挥作用。病原相关分子模式(PAMPs)是指部分病原体和其产物所共有的高度保守的一些特定分子结构等。因此,Toll样受体(TLRs)可以广泛特异性的识别病原微生物,偶联信号传导途径,并激活天然免疫细胞,继而活化更多免疫细胞和导致更大范围的一系列免疫反应。髓样分化因子 88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)、白介素-1 受体相关激酶 1(IL-1/Toll-like receptor associated kines1,IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子 2(Tumor necrosis factor receptor associated factor 2,TRAF 2)、肿瘤坏死因子受体相关因子 6(Tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)、转化生长因子激活激酶 1(TGF-beta activated kinase 1,TAK1)、细胞凋亡信号调节激酶 1(Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)等是 TLRs 相关信号传导过程中的关键分子。髓样分化因子88(MyD88)由296个氨基酸构成,从结构上发现其含有羧基末段TIR结构域和氨基末端死亡结构域(DD)。MyD88可通过自身的羧基末段TIR结构域同IL-IRACP和TLR的TIR区发生同源性相互作用,也可以通过氨基末端死亡结构域(DD)与IRAK家族中的部分分子结合成为信号转导复合物。MyD88是TLRs信号通路中的一个关键的接头分子,其在传递上游信息和在疾病发生发展中均发挥着重要的作用。MyD88与免疫耐受、炎症性肠病、心血管疾病等疾病都有一定关系。在人体至少已发现四种白介素-1受体相关激酶(IL-1/Toll-like receptor associatedkines,IRAK):IRAK1、IRAK2、IRAK3(M)和 IRAK4。IRAK1 在调节机体的天然免疫中起着重要的枢纽样作用。IRAK1与IRAK4有激酶活性,通过与MyD88和TRAF6连接成复合物、从而启动TLRs/IL1介导的信号通路。IRAK1与IRAK4两者之间联系紧密,几乎所有的Toll样受体通路都要与其相连接。MyD88和TRAF6是TLRs相关信号通路中关键分子和转接蛋白,而两者之间的信号转导必须由IRAK1来介导。肿瘤坏死因子受体相关因子(TNF receptor associated factors,TRAFs)是细胞凋亡和细胞应激反应等生理和病理过程中重要的调节因子,其在天然免疫和获得性免疫中均起着重要作用。肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)是Toll样/白细胞介素1受体(Toll/IL-1 receptor,TLR/IL-1R)超家族信号传导通路的重要成分。TRAF2是肿瘤坏死因子受体相关因子超家族蛋白中的一员,在调节TNF-R1介导的激活NF-κB和JNK过程中起重要的作用。在人B淋巴细胞中,TRAF2能够同TRAF6竞争与CD40的接合,从而限制CD40引发的NF-κB信号通路传导过程的能力。TRAF6可以充当IL-1信号传导通路中的转导子,更重要的是TRAF6可以发挥其作为衔接子的作用而正向调节NF-λB的信与传导。细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)可以参与细胞的生长、分化、凋亡等功能活动。ASK1在人体分布非常广泛,ASK1的活性受到诸如磷酸化、寡聚化、蛋白与蛋白之间相互作用等严格的调节控制。活化的ASK1可以依次激活MKK4/MKK7-JNK及MKK3/MKK6-P38等激酶途径,可以参与多种生理和病理过程。ASK1在肿瘤坏死因子α(tumor necrosisfactor α,TNFα)所介导的凋亡中是必须的。TRAF蛋白家族中,TRAF1/2/3/5/6均与ASK1相互作用,而TRAF2/5/6增加ASK1活性。ASK1在TRAF和TRAF6等过度表达下可活化。目前对尖锐湿疣病原体—HPV,至今未找到完全根除的方法。现有的治疗方法均无法从根本上解决复发这一难题,目前尚无足够证据证明能减少疾病的传播。而目前临床上所运用的治疗方法主要是通过物理治疗等方法去除局部良性新生物,口服或注射免疫调节剂,诸多文献报道也证明免疫疗法有一定疗效。HPV导致尖锐湿疣免疫方面的机制受到众多学者的关注。鉴于目前对HPV如何导致尖锐湿疣免疫方面的机制尚不十分清楚,本实验在设计上主要关注低危型HPV(6、11)引起的尖锐湿疣中免疫相关基因的研究,检测其所致尖锐湿疣皮损和正常对照中MyD88、IRAK1、TRAF2、TRAF6、TAK1、ASK1的表达,探讨这些相关基因在尖锐湿疣发病方面的可能作用机制。方法应用可对21种人乳头瘤病毒亚型核酸扩增分型的试剂盒,从临床收集的尖锐湿疣标本30例中,分选出低危型HPV(6、11)24例;以正常成人包皮内板组织13例作为正常对照组。Trizol法提取尖锐湿疣组和正常对照组的组织总RNA后,逆转录为cDNA,应用实时荧光定量PCR、SYBRGreen染料法进行检测;管家基因β-actin为参照基因。待确定管家基因β-actin在尖锐湿疣组和正常对照组标本中恒定表达后,再检测TRAF6等6个基因在两组标本中的表达水平变化。相对基因表达水平计算使用2-△△Ct方法,将所得数据经SPSS 13.0软件进行统计学处理,独立样本t检验分析,显著性水准αα=0.05。结果30例尖锐湿疣标本中,HPV 6感染3例(10.0%,3/30例),HPV 11感染8 例(26.7%,8/30 例),HPV 6/11 感染 13 例(43.3%,13/30 例),HPV(18、33、52、53、68)等感染6例(20.0%,6/30),未检测到HPV 16型感染。分选出低危型HPV(6、11)24例、低危型HPV(6、11)的感染率为80%。内参基因β-actin在尖锐湿疣标本组和正常包皮对照组中表达相对恒定(P>0.05),差异无统计学意义。2-△△Ct方法计算出各个样本2--△△t结果后,用独立样本t检验分析发现:除TAK1(P>0.05)差异无统计学意义外,MyD88、IRAK1、TRAF2、TRAF6、ASK1(P<0.05)在尖锐湿疣组和正常对照组之间差异均具有统计学意义。结论本研究中所检测的30例尖锐湿疣标本中HPV感染率为100%;30例尖锐湿疣标本中80.0%为HPV6和11亚型感染,说明低危型HPV(6、11)是导致尖锐湿疣的主要HPV亚型。根据实时荧光定量PCR检测结果,可以认为MyD88、IRAK1、TRAF2、TRAF6、ASK1在尖锐湿疣组中表达上调,TAK1在尖锐湿疣与正常对照组之间表达无明显变化。MyD88、IRAK1、TRAF2、TRAF6、ASK1表达变化说明其所相关的TLRs介导的信号通路在低危型HPV致尖锐湿疣的免疫机制中可能发挥着重要作用,可能影响到下游的JNK信号通路。可进行更进一步研究,探讨在其尖锐湿疣发生发展中的调节作用及意义,希望可以为尖锐湿疣的诊断和临床防治提供一个新的思路。