第一部分 构建CPT2 F352C 突变小鼠模型　　研究目的：　　肉毒碱棕榈酰基转移酶2（Carnitine Palmitoyltransferase 2，CPT2 ） F352C突变与肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）脑炎的发生发展显著相关，本项目将通过构建与人类一致的CPT2 F352C点突变小鼠，为在体内水平研究CPT2 F352C突变加重EV71脑炎脑干损伤的机制提供更好的动物模型。　　研究方法：　　通过与NCBI数据库，比对人源和小鼠源CPT2序列，明确CPT2蛋白在人源和小鼠源第352号氨基酸都是苯丙氨酸，采用CRISPR/Cas9技术建立点突变小鼠。利用Zhang Lab的在线设计软件http://crispr.mit.edu设计guide-RNA，并根据突变位点设计单链供体序列Oligo Donor DNA，利用NotI位点将Cas9质粒线性化，使用mMESSAGE mMACHINE ? T7 Ultra Kit进行体外转录；guide-RNA模板使用MEGAshortscript?Kit进行体外转录。转录产物都使用MEGAclearTM Kit纯化，取4-6周龄C57BL/6J雌鼠超排后与性成熟的C57BL/6J雄鼠交配，挑选见栓鼠取受精卵，培养在M2培养基中，将纯化的Cas9 mRNA和guide-RNA注射到受精卵中，注射后的受精卵移植到假孕鼠的输卵管，每只假孕鼠输卵管单侧移卵约25枚。胚胎移植成功后，F0代小鼠娩出。提取F0代小鼠小鼠基因组DNA，利用PCR技术扩增后，测序鉴定小鼠基因型，将阳性F0代小鼠继续与野生型小鼠杂交繁育以便获得能稳定遗传的CPT2 F352C点突变小鼠。连续观察小鼠的生长发育情况，记录每周的体重变化，提取突变小鼠及野生型小鼠脑干组织脑干组织总RNA，利用RT-PCR技术检测CPT2 mRNA表达，提取突变小鼠及野生型小鼠脑干组织脑干组织总蛋白，利用Western Blot检测CPT2蛋白的表达。同时测定突变小鼠及野生小鼠脑干组织CPT2剩余酶活性及ATP水平。　　结果：　　经基因型鉴定，共获得4只目的基因点突变的阳性F0代小鼠，经繁育后获得实验所需的纯合型CPT2 F352C突变和野生型小鼠。连续观察CPT2 F352C突变小鼠和野生型小鼠的生长发育情况8周，结果发现，CPT2 F352C突变小鼠和野生型小鼠相同性别的体重增长状况无明显差别，两者的的mRNA水平及蛋白表达也无差异。在无任何干预的情况下，正常CPT2 F352C突变小鼠和野生型小鼠的脑干组织中CPT2剩余酶活性及ATP水平也无显著统计学意义。　　结论：　　成功建立了CPT2 F352C点突变小鼠模型，为研究CPT2 F352C突变后加重EV71脑炎脑干损伤的机制提供了重要的动物模型。　　第二部分 CPT2 F352C 突变加重EV71脑炎脑干损伤的机制　　研究目的：　　在前期构建的CPT2 F352C突变小鼠基础上，研究EV71感染后不同发热状态小鼠的临床症状、脑干组织病毒载量、CPT2的功能、细胞因子的变化及脑干线粒体超微结构和血脑屏障结构的改变，探讨CPT2 F352C突变加重EV71脑炎脑干损伤的机制。　　研究方法：　　利用人横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RD）细胞扩增浓缩EV71 BrCr毒株，经腹腔注射给予野生型小鼠及CPT2 F352C突变小鼠不同量的病毒液，筛选出能产生EV71感染神经症状的最佳病毒量。将7日龄20窝野生型小鼠及20窝CPT2 F352C突变小鼠随机均分为2组，分别为EV71感染组17窝和非感染组3窝，感染组小鼠根据其体温变化，分为高热组(>35.5℃)和非高热组。连续观察各组小鼠EV71感染症状，各组分别于病毒接种前、病毒接种后第3天、第7天、第10天、第14天用苯巴比妥安乐死8只，取出脑干组织，提取总RNA和总蛋白。RT-PCR检测脑干组织中的EV71病毒载量及CPT2mRNA表达量，Western Blot检测CPT2蛋白的表达，测定各组小鼠CPT2剩余酶活性及ATP水平，酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）检测脑干组织中细胞因子白细胞介素-1β（Interleukin-1beta，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alfa,TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）、白细胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、干扰素-γ（Interferon-gama，IFN-γ）、基质金属蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinases-9,MMP-9）、基质金属蛋白酶-2（Matrix Metalloproteinases-2,MMP-2）。透射电镜下观察小鼠脑干线粒体超微结构及血脑屏障的变化。　　结果：　　各组小鼠在感染EV71病毒后出现了严重的EV71感染症状，以CPT2 F352C突变感染伴高热组小鼠感染症状最重，CPT2 F352C突变感染非高热组小鼠与野生型EV71感染非高热组小鼠在感染症状方面并无明显差异。感染后第3天，各组小鼠脑干组织病毒载量就明显升高，第7天达到顶峰，CPT2 F352C突变EV71感染高热组小鼠脑干组织中EV71病毒载量最高，野生型EV71感染高热组小鼠次之，CPT2 F352C突变EV71感染非高热组小鼠与野生型EV71感染非高热组小鼠脑干组织中EV71病毒载量无明显差别，与临床感染症状的发展趋势类似。未感染EV71的CPT2 F352C突变和野生型小鼠脑干组织内CPT2 mRNA及CPT2蛋白无明显差别，感染组各基因型小鼠脑干组织内CPT2 mRNA及CPT2蛋白表达较非感染组各基因型小鼠低，但CPT2 F352C突变感染伴高热组小鼠与其他感染组小鼠并无统计学差异。与非感染对照组相比，EV71感染各组小鼠脑干组织内CPT2剩余酶活性及ATP水平均明显降低，其中CPT2 F352C突变感染伴高热组小鼠降低最明显。另外，EV71感染后各组小鼠脑干组织内IL-1β、TNF-α、MMP-9、MMP-2与同基因型非感染组小鼠相比，明显增高，约在感染后第3天达到高峰，第7天开始下降，第14天基本恢复正常。其中，EV71感染高热组，特别是CPT2 F352C突变感染伴高热组小鼠升高更明显。在CPT2 F352C突变感染伴高热组小鼠中，IL-6、IL-17及IFN-γ/IL-4比值在第3天显著增高后，在感染后第7天迅速降低，降至低于CPT2 F352C突变感染非高热组水平，随后逐渐恢复。电镜结果显示未感染EV71病毒的CPT2 F352C突变小鼠和野生型小鼠脑干线粒体结构完整；EV71感染后第7天，CPT2 F352C突变无高热组小鼠和野生型无高热组线粒体明显肿胀，线粒体嵴减少，两者变化基本一致；野生型高热组线粒体膜结构被破坏，线粒体嵴明显减少；CPT2 F352C突变高热组线粒体破坏最为严重，线粒体膜不连续，线粒体形状不规则，线粒体嵴消失。未感染EV71病毒的CPT2 F352C突变小鼠和野生型小鼠脑干毛细管管腔完整，基膜平滑连续，内皮细胞无肿胀；EV71感染后第7天，CPT2 F352C突变无高热组小鼠和野生型无高热组小鼠毛细血管内皮细胞明显肿胀、甚至出现空泡，管腔变狭窄，部分基膜断裂，两组血脑屏障变化基本相似；野生型高热组小鼠毛细血管内皮细胞间的紧密连接打开，基膜溶解，部分基膜消失，CPT2 F352C突变高热组小鼠毛细血管管腔结构基本被破坏，基膜溶解消失，损伤最为严重。　　结论：　　CPT2 F352C突变加重EV71感染高热小鼠脑干CPT2酶活性减低、ATP产生减少，病毒的清除能力降低，感染早期IL-1β、TNF-α、MMP-9、MMP-2炎性因子分泌增多，中晚期IL-6、IL-17及IFN-γ/IL-4比值迅速降低，加重脑干线粒体及血脑屏障损伤。