论文部分内容阅读
目的 探讨人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)在流体切应力作用下白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)的生成以及切应力的作用时间和作用强度对IL-8生成影响的变化规律;阐明流体切应力通过调节血管内皮细胞表达IL-8对中性粒细胞-内皮细胞黏附的影响及其强度依赖性的变化规律;探讨流体切应力影响中性粒细胞-内皮细胞黏附的可能机制。方法 (1)用低强度的流体切应力(2.09、4.61、6.19 dyne/cm2)处理培养的人脐静脉内皮细胞,作用时间为1h﹑2h﹑3h﹑4h﹑5h﹑6h﹑8h﹑10h﹑12h,以未做任何处理的人脐静脉内皮细胞作为阴性对照。然后采用双抗体夹心ABC-ELISA技术检测内皮细胞IL-8蛋白质的生成;(2)用不同强度的流体切应力(2.09、4.61、6.19、8.51、10.50、12.59、14.41、17.22、18.32 dyne/cm2)处理培养的人脐静脉内皮细胞,作用时间为5h﹑6h,以未做任何处理的人脐静脉内皮细胞作为阴性对照。然后采用双抗体夹心ABC-ELISA技术检测内皮细胞IL-8蛋白质的生成;(3)用不同强度的流体切应力(2.09、8.51、12.59、18.32dyne/cm2)处理培养的人脐静脉内皮细胞5h﹑6h,然后用灌流液激活人外周血中性粒细胞后,观察中性粒细胞与内皮细胞的黏附情况;(4)用不同强度的流体切应力(2.09、8.51、12.59、18.32dyne/cm2)处理培养的人脐静脉内皮细胞,然后用灌流液激活人外周血中性粒细胞后,流式细胞仪测定中性粒细胞<WP=6>表面CD11a/CD18(LFA-1)、CD11b/CD18(Mac-1)的表达量;(5)用抗-LFA-1、抗Mac-1的单克隆抗体、Ca2+拮抗剂处理中性粒细胞后,观察其与切应力处理过的内皮细胞的黏附情况。结果 (1)未用切应力处理的HUVECs IL-8 蛋白质有低水平的基础表达;加载切应力(2.09﹑4.61﹑6.19dyne/cm2)作用1h后即明显增加,和静态对照组相比,分别增加了3.1﹑3.3﹑3.2倍;作用5h后 IL-8 蛋白质表达量至最高值,与静态对照组相比,分别增加了160.9﹑118.5﹑106.2,与1h组相比,分别增加了51.9﹑35.9﹑33.2倍;作用8h 后IL-8 蛋白质表达量开始下降,和5h组的生成量相比,分别下降了32%﹑13%﹑35%;作用10h 后IL-8 蛋白质维持在了一个较稳定的水平,和5h组的生成量相比,分别下降了51%﹑31%﹑34%,但与静态对照组相比,分别增加了81.7﹑97﹑69.4倍。各实验组(2.09﹑4.61﹑6.19dyne/cm2)均表现出相同的IL-8 蛋白质随时间的变化规律,即切应力作用HUVEC 1 h 后,IL-8 蛋白质表达迅速增加,至5 h 达到峰值,8 h 时下降,10 h后IL-8 蛋白质维持在一个较高的水平。(2)未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞后,低切应力(2.09 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量明显增加,为高切应力(18.32 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量的约6(作用5h )或7倍(作用6h )。IL-8 蛋白质生成量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;直线回归方程:5 h 时为y= 760.12─36.06x, 相关系数γ=—0.978;6 h时为y= 781.87 ─36.66x,相关系数γ=—0.980。式中:y为切应力作用下内皮细胞IL-8的生成量;x为施加于内皮细胞的切应力强度(dyne/cm2)。不同的切应力作用时间(5h、6h)均表现出相同的IL-8 蛋白质生成量随切应力强度的变化规律。(3)未用流体切应力处理的内皮细胞,中性粒细胞只有极少量的黏附;2.09 dyne/cm2切应力处理内皮细胞5h或6h 后,用灌流液<WP=7>处理中性粒细胞,中性粒细胞大量黏附;8.51、12.59、18.32dyne/cm2切应力处理内皮细胞5h或6h 后,中性粒细胞黏附百分率又逐渐减少;中性粒细胞黏附率随切应力的增大而降低。低切应力处理内皮细胞5h或6h 后,中性粒细胞黏附百分率是高切应力处理内皮细胞后的约2倍。作为阳性对照的IL-8孵育组也表现出了相同的黏附百分率随切应力的增大而降低的规律。(4)用2.09 dyne/cm2的灌流液激活中性粒细胞后,中性粒细胞表面LFA-1、Mac-1的表达量明显增加,而随着切应力强度的增加(8.51、12.59、18.32dyne/cm2),LFA-1、Mac-1的表达量逐渐降低,中性粒细胞表面LFA-1、Mac-1的表达量随着流体切应力强度的增大而降低。(5)单独使用抗-LFA-1或抗-Mac-1的单克隆抗体处理中性粒细胞后,中性粒细胞-内皮细胞的黏附百分率变化不明显,而同时用抗-LFA-1和抗-Mac-1抗体处理中性粒细胞后,中性粒细胞-内皮细胞的黏附明显抑制,表现出明显的相加效应;用Ca2+拮抗剂后,在低切应力条件下(2.09、8.51 dyne/cm2)的中性粒细胞-内皮细胞黏附明显抑制,而高低切应力条件下(12.59、18.32dyne/cm2)的变化不明显。 结论 (1)未用切应力处理的内皮细胞IL-8只有低水平的基础表达;流体切应力可以诱导内皮细胞表达IL-8,其表达量不仅与切应力的作用时间有关,还与切应力的作用强度有关。切应力作用下内皮细胞被诱导表达IL-8,可能在与其他因素的共同作用下,共同参与急性炎症时复杂的病理生理变化。低切应力时内皮细胞IL-8表达量较高,说明低切应力可能通过诱导内皮细胞表达IL-8而成为动脉粥样硬化的始发因素之一;高切应力时IL-8的表达量较低,说明高切应力可能具有抗动脉粥样硬化的作用。(2)未用切应力处理的内皮细胞只与极少的中性粒细胞黏附;中性粒细胞-内皮细胞的黏附与切应力的作用强度有关,低切应力时,中性粒细胞-内皮细胞的黏附百分率明显