纤维堆囊菌So2161及其分散型突变株SoL4-29的差异研究

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纤维堆囊菌是抗癌新药埃博霉素的产生菌,其生长呈现聚团现象,这一特性是菌体的一种自我保护机制,但在一定程度上抑制了菌体的生长,影响了代谢产物的生成,也不利于基因操作。  我们运用传统的紫外诱变手段以纤维堆囊菌So2161为出发菌株获得了分散型突变株L4,对其进行上清传代驯化,检测各代菌株的分散度、菌体量以及埃博霉素产量,最后选取第29代菌株作为分散型菌株的代表进行研究,命名为SoL4-29。  本文分别从表型、胞外多糖产量、蛋白酪氨酸磷酸酶活性和sce8244基因表达量水平上对野生型菌株So2161和分散型菌株SoL4-29进行差异性比较研究。针对表型差异主要比较了两株菌在不同培养基中的形态差异、显微镜下的细胞形态、菌体生长速度、菌体量、分散程度几方面的异同。观察发现野生型菌株无论在固体培养基还是液体培养基中都聚团生长,而分散菌株在两种培养基中都呈现均匀分散生长性状,通过OD600值的检测进一步验证了两株菌的分散程度差异。另外,分散型菌株的生长速度相对野生型菌株有所提高,但菌体总量略有降低。  胞外多糖是控制菌体分散性的重要因素,本文中首先用染料法检测野生型菌株和分散菌株的胞外多糖含量,使用刚果红和台盼蓝两种染料,菌体胞外多糖能够与染料结合,发生颜色的变化,通过检测两种染料的吸光度变化(刚果红490nm、台盼蓝585nm)来确定胞外多糖与染料的结合率,结果野生型菌株的两种染料结合率都高于分散菌株,其胞外多糖含量相对较高。为验证染料法的结果,进一步用苯酚硫酸法检测两株菌在5天的生长过程中胞外多糖每天的合成量,结果与染料法趋势相同。  蛋白酪氨酸磷酸酶是与胞外多糖合成相关的酶,蛋白酪氨酸激酶能够促进酪氨酸磷酸化,蛋白酪氨酸磷酸酶又使其脱磷酸化,它们共同作用调节胞外多糖的合成。我们分别检测两株菌中蛋白酪氨酸磷酸酶的活性,以磷酸对硝基苯(pNPP)为反应底物,加入粗酶液,通过检测生成的pNP的量来定义蛋白酪氨酸磷酸酶的酶活,结果显示分散型菌株的酶活性较野生型菌株要高。Sce8244基因是一种蛋白酪氨酸磷酸酶基因,用实时荧光定量PCR分析此基因的表达量,以16S rRNA为内参基因,分别检测两株菌位于生长对数期和稳定期的sce8244基因表达量,结果显示,分散菌株的基因表达量高于野生型菌株,这与酶活检测结果一致说明蛋白酪氨酸磷酸酶与胞外多糖的含量呈现负相关。  另外,我们在野生型菌株So2161培养基中添加重金属离子Mn2+和Co2+,当金属离子浓度在一定范围内时能够促进菌体不同程度地分散并且不影响菌体生长,但当金属离子浓度时过高则会造成菌体生长不良或致死。
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