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目的1.在伊立替康迟发性腹泻大鼠模型上,研究探讨中药生姜泻心汤对肠粘膜细胞凋亡、细胞增殖和干细胞标志物表达、肝脏UGT1A1、肠道β-葡萄糖醛酸酶活性的影响,揭示该方在预防伊立替康肠毒性的作用靶点和作用机制,为中药预防化疗性腹泻提供科学依据。2.为临床应用生姜泻心汤预防伊立替康肠毒性提供实验依据。方法中药的作用具有多靶点的特点,探索中药生姜泻心汤在不同靶点抑制化疗性肠毒性的作用,是阐明对肠毒性预防机理的关键。根据伊立替康的代谢及其肠毒性的发生机制,利用伊立替康腹泻大鼠模型进行体内试验,从调节肝脏UGT1A1酶、肠道β-葡萄糖醛酸酶以及促进肠粘膜自身修复机能三个环节进行研究。1.建立伊立替康腹泻模型大鼠;2.通过观察实验过程中各组大鼠体重、进食量的变化,验证生姜泻心汤对伊立替康腹泻模型大鼠一般状况的影响;并根据文献记载腹泻等级和评分标准,对各组大鼠在伊立替康注射后进行腹泻评估,验证生姜泻心汤对伊立替康腹泻模型大鼠腹泻症状的影响;3.通过HE染色技术,观察伊立替康对腹泻模型大鼠空肠、回肠、盲肠、结肠肠粘膜的损伤作用,并对比各组大鼠间不同肠段肠粘膜在镜下病理上的差异,验证生姜泻心汤对伊立替康腹泻模型大鼠肠粘膜损伤的影响;4.通过TUNEL染色和caspase-3酶活性检测技术,分别定性和定量的检测各组大鼠空肠肠粘膜细胞的凋亡状况,验证生姜泻心汤对伊立替康腹泻模型大鼠肠粘膜细胞凋亡的影响;5.通过免疫组化染色技术,采用增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和细胞黏附分子(homing cell adhesion molecule,CD44)抗体分别染色标记空肠中增殖的肠粘膜细胞和肠隐窝处的肠干细胞,观察各组大鼠空肠粘膜上皮细胞和肠干细胞在镜下的染色情况,并通过Image-Pro Plus(IPP)软件测定所拍摄的图像中染色部分的整体光密度(Integrated option density,IOD)值,并计数每个视野下PCNA染色阳性细胞数目,定量地分析各组大鼠空肠粘膜上皮细胞和肠干细胞表达的差异性,验证生姜泻心汤对伊立替康腹泻模型大鼠肠粘膜细胞增殖的影响;6.通过实时定量PCR技术,检测各组大鼠空肠组织肠干细胞标志物Lgr5 mRNA表达情况,从mRNA水平验证生姜泻心汤对伊立替康腹泻模型大鼠肠干细胞表达的影响;7.通过酶活性检测技术,测定各组大鼠肠道粪便中β-葡萄糖醛酸酶活性,验证生姜泻心汤对伊立替康腹泻模型大鼠肠道内环境的影响;8.通过实时定量PCR技术,检测各组大鼠肝脏组织UGT1A1 mRNA表达情况,验证生姜泻心汤对伊立替康腹泻模型大鼠肝脏代谢酶的调节作用。结果1.通过对伊立替康腹泻模型大鼠一般情况、腹泻症状的观察,及对其肠粘膜病理、免疫组化的检测,均证实伊立替康腹泻模型大鼠造模成功;2.对各组大鼠一般情况的观察结果显示,从实验第7天(末次注射伊立替康后48h)起,中、高剂量中药组大鼠的累积体重增加值显著高于模型对照组(p<0.05,p<0.01),但不同剂量中药组间的差异不具有统计学意义,直到第9天,与低剂量中药组相比,高剂量中药组大鼠才显示出更高的累积体重增加值(p<0.05)。从实验第4天起,与空白对照组相比,模型对照组和低、中、高剂量中药组大鼠进食量显著减少(p<0.01),而各剂量中药组大鼠进食量恢复明显快于模型对照组;至实验第9天,模型对照组大鼠的进食量仍显著低于空白对照组(p<0.01),各剂量中药组大鼠的进食量则显著高于模型对照组(p<0.01),而与空白对照组无差异,但不同剂量中药组间的差异不具有统计学意义。对各组大鼠腹泻症状的观察结果显示,末次伊立替康注射24h后,模型对照组和各剂量中药组大鼠的腹泻评分均值开始升高,其中模型对照组大鼠腹泻评分升高幅度明显高于各剂量中药组,在末次用药60h和70h后,与模型对照组相比,中剂量和高剂量中药组大鼠的腹泻等级分布均具有明显差异(p<0.05,p<0.01)3.肠粘膜病理镜下观察结果显示,模型对照组大鼠肠粘膜可观察到伊立替康引起的损伤,包括:肠上皮大体结构不完整、上皮细胞排列紊乱、肠隐窝和肠绒毛减少、变短等,其中,以空肠、盲肠黏膜的损伤最为严重;而低、中、高剂量中药组大鼠肠黏膜结构更加完整,肠隐窝和肠绒毛得到了更好的保存。4.TUNEL染色和caspase-3酶活性检测结果显示,中药组镜下空肠黏膜阳性凋亡细胞明显少于模型对照组,且低、中、高剂量中药组肠道caspase-3酶活性(U)分别为0.66±0.10、0.48±0.11、0.68±0.19,均明显低于模型对照组(vs1.00±0.17,p<0.01);5.PCNA和CD44染色标记免疫组化检测结果显示,高剂量中药组PCNA阳性细胞数明显高于模型对照组(531.20±101.64 vs 312.40±43.23,p<0.01);高剂量中药组PCNA 的 IOD 值明显高于模型对照组(2494.93±615.00 vs 1026.26±339.00,p<0.05);中、高剂量中药组CD44的IOD值分别为511.35±83.18、613.04±102.42,均明显高于模型对照组(vs 360.99± 156.87,p<0.05,p<0.01);6.实时定量PCR技术结果显示,与模型对照组相比,各剂量中药组大鼠肠道Lgr5 mRNA表达均有所增多,但只有高剂量中药组Lgr5 mRNA表达显著增多,具有统计学意义(1.75±0.53 vs 0.56±0.54,p<0.01);7.β 葡萄糖醛酸酶活性检测结果显示,在伊立替康注射前,与空白对照组、模型对照组相比,低、中剂量中药组大鼠肠道粪便β-葡萄糖醛酸酶活性无明显差异;而高剂量中药组大鼠肠道粪便β-葡萄糖醛酸酶活性明显低于模型对照组(3.88±1.78 vs 5.92±1.47,p<0.05);在注射伊立替康后,低、中、高剂量中药组β-葡萄糖醛酸酶活性分别为12.56±1.81、13.55±1.17、11.62±1.78,均明显低于模型对照组(vs 16.09± 1.40,p<0.05,p<0.01),而各剂量中药组间的差异并不显著;8.实时定量PCR技术结果显示,与空白对照组相比,模型对照组和低、中、高剂量中药组大鼠肝脏UGT1A1酶mRNA表达显著降低;而与模型对照组相比,各剂量中药组大鼠肝脏UGT1A1酶mRNA的表达均未表现出明显差异。结论1.生姜泻心汤可有效减轻伊立替康所引起的体重下降,促进注射伊立替康后大鼠的进食;2.生姜泻心汤可以降低伊立替康所引起的腹泻级别和评分;3.生姜泻心汤可以减轻伊立替康引起的肠粘膜病理性损伤;4.生姜泻心汤可减少伊立替康所导致的肠道细胞凋亡;5.生姜泻心汤可促进肠黏膜细胞的增殖;6.生姜泻心汤可促进肠干细胞的表达;7.生姜泻心汤可降低大鼠注射伊立替康后肠道粪便中β-葡萄糖醛酸酶活性;8.生姜泻心汤对肝脏UGT1A1酶mRNA的表达无明显影响。