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微生物耐药性逐渐增加,使得人们对新型的抗菌药物的研发需求越来越强烈。抗菌肽是一类两亲性的小分子多肽,可从哺乳动物,昆虫,植物,海洋生物等分离得到,具有抗细菌,真菌,肿瘤细胞等生物活性。抗菌肽有四种作用机制:a抗菌肽与细胞膜相互作用;b抗菌肽与细胞壁相互作用;c抗菌肽与细胞内核酸相互作用;d抗菌肽与细胞的酶相互作用。抗菌肽的结构、理化性质等特点决定着抗菌肽的独特作用机制。昆虫是生物界种类最多的物种,能够在条件极其恶劣的环境生存。昆虫抗菌肽来源丰富,稳定性较好,多数为水溶性,具有广谱的抗菌活性。光滑鳖甲生活在新疆昼夜温差大、季节温度变幅大,生存条件极其恶劣的准噶尔盆地荒漠中,其种群数量非常庞大,是研究荒漠昆虫抗菌免疫机制的理想材料。近年来,随着人们对抗菌肽深入研究,发现抗菌肽除了有抑菌作用,还有抗真菌,肿瘤细胞的生物学活性。本实验用细菌感染光滑鳖甲幼虫使其产生免疫反应,运用Trizol法提取幼虫RNA,采用PCR技术克隆得到光滑鳖甲抗菌肽基因序列。通过基因工程技术中的原核表达、亲和层析、免疫印迹等方法对光滑鳖甲抗菌肽进行了原核表达,蛋白纯化及鉴定,并采用抑菌圈、测定细菌生长曲线的方式检测其生物活性,其结果如下:1.本研究克隆得到了光滑鳖甲抗菌肽基因Ap AMP55、Ap AMP85和Ap AMP1015。克隆得到的基因Ap AMP55全长252bp,编码83个氨基酸,其中包含由18个氨基酸组成的信号肽、22个氨基酸残基组成的前体肽和43个氨基酸组成的成熟肽;基因Ap AMP85全长456bp,编码151个氨基酸,其中17个氨基酸组成信号肽,134个氨基酸组成成熟肽;基因Ap AMP1015全长387bp,编码128个氨基酸,其中包含19个氨基酸组成的信号肽、35个氨基酸组成的前体肽和74个氨基酸组成的成熟肽。光滑鳖甲抗菌肽基因的克隆丰富了现有抗菌肽数据。2.对三个光滑鳖甲多肽Ap AMP55、Ap AMP85和Ap AMP1015的组成、结构、疏水性、电荷等理化性质参数进行生物信息学分析。多肽Ap AMP55是整个分子带有2个正电荷的疏水性稳定蛋白,二级结构由6.02%的α螺旋,49.4%的无规卷曲,44.8%的延伸链;多肽Ap AMP85带有3个正电荷,是稳定的亲水蛋白,二级结构中α螺旋占的比例为11.26%,无规卷曲占60.26%,延伸链占28.48%;多肽Ap AMP1015分子带一个负电荷,是不稳定的亲水蛋白,二级结构中α螺旋占的比例为20.31%,无规卷曲占60.94%,延伸链占18.75%。这些理化参数和结构特性为研究光滑鳖甲抗菌肽的可能存在的功能及作用机制提供依据。3.本研究构建了光滑鳖甲抗菌肽Ap AMP85基因,Ap AMP1015基因和Ap AMP55基因原核表达系统,并成功诱导表达了25KD的融合蛋白Trx A-Ap AMP55、35KD的Trx A-Ap AMP85和35KD的Trx A-Ap AMP1015进行了诱导表达。4.获得光滑鳖甲抗菌肽融合蛋白Trx A-Ap AMP1015在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件:0.1mmol/L IPTG,25℃,150rpm诱导6h,为光滑鳖甲抗菌肽的应用,大规模生产等方面奠定基础。5.初步探索了光滑鳖甲抗菌肽的表达条件及生物学活性,发现光滑鳖甲抗菌肽融合蛋白Trx A-Ap AMP1015能够抑制大肠杆菌的生长,而抗菌肽融合蛋白Trx A-Ap AMP55和抗菌肽融合蛋白Trx A-Ap AMP85还未发现具有有效的抗菌肽活性,有待于进一步探究。该结果为光滑鳖甲抗菌肽的应用和进一步研究奠定了基础。