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禽白细胞介素2(IL-2)主要是由激活的T淋巴细胞分泌的一种细胞因子,对机体的免疫反应具有重要的调节作用,因此作为天然的免疫佐剂和免疫增强剂具有很好的应用潜力。
将鸡和鹅IL-2成熟蛋白的编码基因分别插入到pET28a(+)原核表达载体多克隆位点,构建pET28a(+)-chIL-2和pET28a(+)-goIL-2重组子,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,实现了鸡和鹅IL-2基因的体外重组表达。经SDS-PAGE鉴定,表达蛋白分子量分别为14.9 kDa和15.0 kDa,Western-blotting分析显示重组鸡和鹅IL-2蛋白能分别被抗鸡和鹅IL-2的单克隆抗体和兔多克隆抗体识别。pET28a(+)系统表达的重组鸡和鹅IL-2(rchIL-2,rgoIL-2)蛋白大多以包涵体的形式存在,部分以可溶形式存在,经镍柱天然可溶性纯化,Bradford法定量产率分别为3.2 mg/L和4.0 mg/L,经dot-ELISA鉴定仍能与其特异性的单克隆抗体发生反应。镍柱天然纯化的重组鸡和鹅IL-2蛋白经过滤,过(A)KTA FPLC柱分级分离,得到可溶性的蛋白单体,并在简单氧化还原缓冲溶液中进行复性,获得了重组鸡和鹅IL-2蛋白的复性单体。
为了研究重组禽IL-2蛋白的潜在毒性作用,经静脉和肌肉注射rchIL-2,rduIL-2和rgoIL-2蛋白2次(每周1次),没有可见的临床症状及组织病理学变化。而经静脉连续注射(每天2次)rchIL-2和rduIL-2蛋白至第3次时,实验鸡和鸭表现体温升高,精神沉郁,食欲不振等临床症状,至第5次时所有受试鸡和鸭均死亡。相同注射剂量下,鹅的体温升高不明显,饮食欲基本正常,至第5次时没有导致鹅只死亡。病理学分析表明鸡、鸭和鹅表现出相类似的病理变化:脾小体中淋巴细胞减少;肺泡壁毛细血管扩张,出血,并有炎性淋巴细胞浸润;肝细胞出现脂肪变性和水泡变性:肾小管上皮细胞变性、脱落,间质中有炎性细胞浸润等。分别经静脉和肌肉注射方式给予rchIL-2,rduIL-2和rgoIL-2后,不同时间点采集血样,抗原捕获ELISA法检测禽血清中IL-2在体内的代谢情况,结果表明,静注2 min左右,血清中IL-2水平下降一半,随后迅速下降,5 min后基本检测不到;而肌注后2 h左右,血清中IL-2水平达到最高峰,随后缓慢下降至很低的水平。
经肌肉注射rchIL-2,rduIL-2和rgoIL-2蛋白一个月后,用间接ELISA法检测血清中抗IL-2的抗体,其中试验鸡的血清样本中95％(24/30)为抗体阴性,5％(6/30)为可疑,试验鸭和鹅的血清样本中100％(0/30)为抗体阴性,提示重组禽IL-2蛋白不会引起自身免疫反应。经肌肉注射rchIL-2,rduIL-2和rgoIL-2蛋白后,分别于第1、5、10、20和30天随机采集禽的肛拭子,涂布LB平板(卡那抗性),分离细菌,挑斑后扩繁,碱法抽提质粒,电泳鉴定未发现有质粒条带出现,说明重组质粒的抗性标记基因没有引起环境残留。
以上结果表明基因工程方法表达的重组禽IL-2蛋白在正常使用剂量及时间间隔下对受试动物是安全的,不会引起自身免疫反应,但大剂量连续静脉注射可导致严重的毒副作用,这些实验数据为其临床使用提供了理论基础。