研究背景:多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是以恶性浆细胞大量积聚于骨髓为特征的B淋巴细胞肿瘤。MM细胞高度依赖骨髓微环境,且能够通过分泌细胞因子或直接接触改造周围的免疫细胞,营造有利于肿瘤生长的免疫抑制性微环境。巨噬细胞(macrophages,MΦs)在MM患者骨髓中含量丰富,能够促进肿瘤细胞生长、增殖和耐药,且参与免疫抑制性微环境的形成。我们的前期研究发现,白细胞介素32(interleukin32,IL-32)在MM患者中的表达明显高于健康对照,且能够通过骨髓基质细胞促进MM细胞增殖。然而关于IL-32对MM微环境中MΦs的作用尚无相关研究。本实验旨在探索IL-32对MΦs表型和功能的调控及其分子机制,以及最终对MM细胞增殖和耐药所产生的影响。研究目的:1.明确IL-32在MM患者的表达情况及其临床意义。2.探讨IL-32对MΦs表型的调控及其机制,以及对MM耐药的影响。3.探索IL-32对MΦs免疫抑制功能的作用,继而对CD4 T细胞增殖和功能的影响。研究方法:1.免疫组化检测MM患者骨髓中IL-32的表达,qRT-PCR和Westernblot检测MM细胞中IL-32各亚型的表达量及活性。2.流式细胞术、细胞因子芯片、qRT-PCR和Westernblot检测经过IL-32γ刺激后MΦs中M1型和M2型特征性表面分子、细胞因子和代谢酶等表达的改变。3.经过IL-32γ刺激后的MΦs和MM细胞共培养,流式细胞术检测MM细胞凋亡,Westernblot检测MM细胞内凋亡蛋白;NSG鼠体内验证IL-32γ诱导M2型MΦs在MM耐药中的作用。4.Westernblot、qRT-PCR和免疫荧光检测MM细胞或IL-32γ作用后MΦs中吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)的表达;利用短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)和小干扰RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)敲减MM细胞中IL-32和MΦs中蛋白酶3(Proteinase3,PR3)后,观察上述现象的改变。5.CFSE示踪检测CD4 T细胞的增殖,流式细胞术检测CD4 T细胞的活力及细胞因子的表达。研究结果:1.IL-32在MM患者中呈高表达,且与ISS分期和血清β2-微球蛋白正相关;IL-32γ是MM细胞中含量较高,且活性最强的亚型。2.IL-32γ能够诱导M2型MΦs极化,且增强MΦs对MM细胞的保护作用,诱导耐药;上述效应可被CSF-1R抑制剂所削弱。3.NSG鼠成瘤模型中,IL-32γ预处理后的MΦs能够减弱MM细胞对Bor的药物敏感性,增加肿瘤负荷。4.IL-32γ能够促进MΦs中免疫抑制性分子IDO的表达,呈浓度和时间依赖。5.MM细胞具备上调MΦs中IDO的能力,当细胞中的IL-32被shRNA敲减后,该能力明显减弱。6.PR3普遍表达于MΦs细胞表面,且能够与IL-32相结合;MΦs中PR3被siRNA干扰后,IL-32γ诱导MΦs中IDO表达的效应将明显减弱。7.IL-32γ能够明显激活MΦs内STAT3和NF-κB通路,使用相应通路的抑制剂后,IL-32γ上调IDO的能力明显下降。8.经过IL-32γ刺激后的MΦs能够抑制CD4 T细胞的增殖和细胞中IL-2,IFN-γ和TNF-α的表达。结论:本项研究发现IL-32在MM患者中高表达,且与ISS分期和血清β2-微球蛋白明显相关。在微环境中,IL-32γ通过上调M-CSF的表达诱导M2型MΦs极化,进而增强MΦs对MM细胞的保护作用,诱导MM耐药。此外,MM细胞来源的IL-32γ通过结合PR3受体,激活STAT3、NF-κB信号通路上调MΦs中IDO的表达,进而抑制CD4 T细胞的增殖和功能,促进免疫抑制性骨髓微环境的形成。