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FOXL2是叉头状转录因子超家族的成员之一,特异性表达于卵巢颗粒细胞,对卵泡的发育至关重要。本实验室在鸡卵巢颗粒细胞中改变FOXL2表达水平后的RNA测序中发现,FOXL2不仅调控如类固醇激素合成酶、雌激素受体等的转录,它还与颗粒细胞中的胶原蛋白家族基因的表达密切相关。本研究在不同时期颗粒细胞(前体颗粒细胞(pre-GC)、等级前卵泡颗粒细胞(ph-GC)和排卵前卵泡颗粒细胞(po-GC))中超表达FOXL2,探究其对颗粒细胞中胶原蛋白基因表达的影响,同时通过双荧光素酶报告系统和染色质免疫沉淀技术(Ch IP)对FOXL2如何调控胶原蛋白基因的表达进行研究。主要研究结果如下:(1)向不同时期颗粒细胞和鸡胚成纤维细胞(DF-1)中转染pc DNA3.1-FOXL2,48h后ELISA检测细胞上清中总胶原蛋白表达量,结果显示,pre-GC的总胶原蛋白表达量显著降低(P<0.05),po-GC中的总胶原蛋白表达量显著升高(P<0.05),而ph-GC和DF-1中的无显著变化,说明FOXL2能影响部分鸡卵泡颗粒细胞中的胶原蛋白表达;(2)为了进一步探究FOXL2对颗粒细胞中具体的胶原蛋白基因的影响,向不同时期颗粒细胞和鸡胚成纤维细胞(DF-1)中转染pc DNA3.1-FOXL2,通过q PCR检测FOXL2和COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A4、COL5A2、COL6A3以及COL8A1在m RNA水平的表达量,结果发现,FOXL2在各细胞中超表达5-60倍,且各细胞中COL4A1的表达量均随着FOXL2的超表达显著降低(P<0.05);(3)已知FOXL2在各时期颗粒细胞中显著降低COL4A1的m RNA表达水平,为了深入探究其是否影响COL4A1蛋白水平的表达,向不同时期鸡卵泡颗粒细胞和鸡胚成纤维细胞(DF-1)中转染pc DNA3.1-FOXL2,通过蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)进行验证,结果显示,在各时期颗粒细胞和DF-1中,超表达FOXL2会显著降低COL4A1的蛋白表达量(P<0.05);(4)成功构建COL4A1启动子双荧光素酶报告基因载体PGL3-COL4A1-WT(正常序列载体)和PGL3-COL4A1-MUT(突变序列载体),并将其与pc DNA3.1-FOXL2分别共转染进DF-1中,48h后进行荧光检测。结果显示,相较于对照组,PGL3-COL4A1-WT和pc DNA3.1-FOXL2共转组的荧光值显著降低(P<0.05),而PGL3-COL4A1-MUT和pc DNA3.1-FOXL2共转组与对照组的荧光值无显著差异(P>0.05)。表明FOXL2直接调控COL4A1的转录,结合位点位于COL4A1编码区上游-640 bp到-625 bp之间,序列为CAGCAGCACCAGCAG;(5)构建含HA标签蛋白的FOXL2超表达载体(PCMV-FOXL2-C-HA)并将其转染进DF-1中,通过q PCR检测到FOXL2的超表达(P<0.001);为了进一步验证载体特异性,又通过Ch IP-WB技术利用抗HA抗体检测到明显的FOXL2蛋白条带;(6)向DF-1中转染PCMV-FOXL2-C-HA载体,通过Ch IP-q PCR检测到抗HA抗体富集的启动子序列是抗Ig G富集序列的2倍(P<0.05),再一次验证了FOXL2对COL4A1有直接调控作用。综上,本研究发现在鸡卵泡颗粒细胞中FOXL2能够调控不同的胶原蛋白基因表达,其中FOXL2能与COL4A1编码区上游-640 bp到-625 bp间的CAGCAGCACCAGCAG序列结合直接调控该基因表达,这种调节的生物学意义尚需进一步研究。