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目的:原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是严重影响我国人民健康的一种重大疾病,每年我国新发病例都占据全球总数的50%以上。由于缺乏有效的早期HCC筛查标志,同时对HCC的早期发生和恶性进展机制的了解不足,导致HCC患者存活率比较低。文献报道上皮-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)和肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)都被认为与肿瘤细胞的恶性进展有关,同时有学者认为HCC的发生可能是正常肝干细胞(liver normal stem cells,LNSCs)反复发生EMT的结果。然而,关于EMT的发生机制及信号通路揭示还不够完善,仍需要进一步研究阐明。近年来研究发现,ATP酶家族AAA结构域蛋白3A(ATPase family AAA-domain protein 3A,ATAD3A)在肺腺癌、神经胶质瘤和乳腺癌等多种癌症中存在较高表达,且与药物耐受、增殖速率和侵袭转移等方面都密切相关,同时还发现与多种生命体的发育关系密切,但是其在LNSCs和HCC中的作用尚未见报道。因此,深入探讨ATAD3A与LNSCs的关系,分析ATAD3A基因对LNSCs细胞恶性转化的影响显得十分重要。由此,本研究拟探索过表达ATAD3A对正常大鼠肝干细胞系WB-F344发生恶性转化的调控作用,并揭示ATAD3A基因诱导的EMT过程是WB-F344发生恶性转化的关键机制;进一步明确ATAD3A对EMT启动因子TGF-β变化的调控是WB-F344发生EMT的具体分子机制。总之,本课题将阐明ATAD3A诱导EMT的发生促进肝干细胞恶性转化的分子机制。方法:1.体外培养大鼠肝干细胞系(WB-F344),按实验所需分别分组为正常对照组(normal)、空载对照组(vector)和过表达组(over expression-ATAD3A,OE-ATAD3A),利用慢病毒转染技术将含过表达ATAD3A基因的载体转入WB-F344细胞,用荧光显微镜观察病毒转染效率,构建稳定过表达ATAD3A基因的WB-F344细胞株。2.利用显微镜观察细胞的形态是否发生变化;采用细胞划痕实验检验各实验组细胞的迁移效率;应用Transwell小室结晶紫染色的方法检测各组细胞的侵袭能力;初步分析ATAD3A基因对WB-F344细胞发生恶性转化的影响。3.应用实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)技术和蛋白免疫印迹技术(western blot,WB)验证EMT的内皮相关标志和间充质相关标志的基因和蛋白表达,分别是E-cadherin和N-cadherin。同时验证相关转录蛋白ZEB1和ZEB2的基因和蛋白的表达,以研究ATAD3A基因的过表达对WB-F344细胞发生EMT的影响。4.运用si RNA瞬时转染技术,沉默OE-ATAD3A组中的TGF-β基因(si-OE-ATAD3A组)。应用RT-PCR技术和WB技术检测干扰表达后TGF-β的m RNA和蛋白表达量变化,确认瞬时转染成功沉默目标;应用RT-PCR技术和WB技术再次检测EMT的内皮和间充质相关标记物的基因和蛋白表达,与OE-ATAD3A组比较是否得到回复。探索ATAD3A和TGF-β变化的调控关系以阐释ATAD3A通过调控TGF-β对EMT启动的影响。结果:1.荧光显微镜观察首次转染时发绿色荧光细胞达95%,传代后100%发绿色荧光;RT-PCR检测结果显示与normal组和vector组相比较,OE-ATAD3A组的ATAD3A基因表达明显升高,其相对表达量约为其余两组的20倍;WB检测结果显示OE-ATAD3A组中ATAD3A蛋白的表达明显升高。2.普通倒置光学显微镜观察结果显示,normal组和vector组细胞形态无明显变化,而OE-ATAD3A组细胞由卵圆形上皮样细胞向长条形和梭形的间充质细胞形态特征变化,开始生长伪足;划痕愈合实验结果显示,normal组和vector组经过72 h的生长,细胞密度虽然生长至很高,且已出现堆叠死亡但痕迹变化很慢,而OE-ATAD3A组细胞的痕迹已基本愈合,原有痕迹即将消失;Transwell小室侵袭实验和结晶紫染色结果显示,下层小室中normal组、vector组细胞的结晶紫染色数量明显少于OE-ATAD3A组。3.RT-PCR检测结果显示,与normal组和vector组相比较,OE-ATAD3A组中E-cadherin的m RNA表达量明显降低,而N-cadherin的m RNA表达量则明显升高;且与EMT相关的转录因子ZEB1和ZEB2的m RNA表达量也明显增多;同时用WB检测结果显示蛋白的变化情况同m RNA保持一致。4.在瞬时转染si RNA的48 h后,用RT-PCR技术检测结果显示si-OE-ATAD3A组TGF-β的m RNA表达水平比OE-ATAD3A组显著降低,并在72 h后用WB技术检测结果显示TGF-β的蛋白表达水平同样也比OE-ATAD3A组显著降低。同时再次检测与EMT相关内皮和间充质标志的m RNA表达和蛋白的表达变化。结果表明,与OE-ATAD3A组相比较,si-OE-ATAD3A组的E-cadherin的表达得到明显回升,而N-cadherin的表现为下降的状态。结论:成功构建了能稳定过表达ATAD3A基因的WB-F344细胞系,为后续研究提供了模型基础;过表达ATAD3A基因能诱导WB-F344细胞发生恶性转化现象,表现为形态改变同时侵袭和迁移能力增强;过表达ATAD3A基因诱导WB-F344细胞EMT的发生发展,探讨了ATAD3A基因对EMT相关过程的调控作用;在过表达ATAD3A基因时沉默TGF-β基因,已发生的EMT反应被抑制,说明ATAD3A通过调控TGF-β相关信号通路对WB-F344细胞的EMT启动影响。综上,揭示ATAD3A促进LNSCs发生EMT转化的相关机制,这些将有助于为LCSCs起源学说提供理论支持,为HCC的早期诊断提供潜在的分子标记,同时为LNSCs治疗HCC提供理论指导。