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鱼类细菌性疾病一直是限制水产养殖业发展的重要因素之一,其中嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是淡水中一种常见的条件致病菌,而利用益生菌替代抗生素来防治疾病在养殖业上得到高度关注。本实验室从草鱼(Ctenopharyngodon idella)肠道中分离出一株枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtllis)Ch9,发现其对草鱼的生长,免疫等有良好的益生作用。本文主要研究了Ch9菌株对感染嗜水气单胞菌的草鱼肠道细胞凋亡的影响。分析了草鱼口灌枯草芽孢杆菌3天后,用嗜水气单胞菌口灌攻毒的结果。实验分为3组:对照组(Control),第1、3、5、6天口灌磷酸缓冲液(PBS);Ah组(A.hydrophila group),第1、3、5天口灌PBS后第6天口灌嗜水气单胞菌;Bs+Ah组(B.Subtllis+A.hydrophila group),第1、3、5天口灌枯草芽孢杆菌Ch9后第6天口灌嗜水气单胞菌。收集嗜水气单胞菌攻毒后0h,12h,24h,48h,72h和96h的草鱼肠道组织,应用原位末端标记法(TUNEL)测定细胞凋亡,实时荧光定量PCR检测caspase-3,caspase-8和bcl-2的基因表达,苏木精-伊红(H&E)染色观察分析肠道组织结构的变化以及检测caspase-3,caspase-8的活化情况。TUNEL结果证明,枯草芽孢杆菌在草鱼肠道受到嗜水气单胞菌感染时,能有效的诱导肠道细胞凋亡,同时caspase-3和caspase-8的活性也显著增加,降低了嗜水气单胞菌引起的肠道损伤。但caspase-3,caspase-8和bcl-2的基因转录水平无显著变化。这些结果表明枯草芽孢杆菌Ch9增加了草鱼肠道嗜水气单胞菌诱导的细胞凋亡,枯草芽孢杆菌Ch9诱导的细胞凋亡可能在草鱼肠道受到细菌攻击时发挥重要的作用。为了进一步探讨枯草芽孢杆菌Ch9的保护机制,分析了嗜水气单胞菌口灌攻毒后口灌枯草芽孢杆菌Ch9的肠上皮细胞凋亡。实验分为2组:Ah组(A.hydrophila group),口灌嗜水气单胞菌后第2、4天口灌PBS;Ah+Bs组(A.hydrophila+B.Subtllis group),口灌嗜水气单胞菌后第2、4天口灌枯草芽孢杆菌。收集嗜水气单胞菌攻毒后3、4、5、6、7天的草鱼肠道组织,通过TUNEL以及caspase-3和caspase-8活性的检测观察细胞凋亡情况。实验结果表明枯草芽孢杆菌促进了细胞凋亡,对肠道损伤有一定的修复作用。在体外实验中,使用Caco-2细胞系作为肠细胞模型,分析了Caco-2细胞在不同浓度嗜水气单胞菌和枯草芽孢杆菌Ch9单独或混合培养下的存活率和细胞毒性。Caspase-3和caspase-8的活性检测,实验分为4组:对照组(Control),新鲜细胞培养液培养;Ah组(A.hydrophila group),新鲜细胞培养液稀释的嗜水气单胞菌培养;Bs组(B.Subtllis group),新鲜细胞培养液稀释的枯草芽孢杆菌Ch9培养;Ah+Bs组(A.hydrophila+B.Subtllis group)新鲜细胞培养液稀释的嗜水气单胞菌和枯草芽孢杆菌Ch9混合培养。在接种后0.5h,1h,1.5h,3h,6h收集样品检测。从细胞凋亡的角度探讨枯草芽孢杆菌Ch9对肠道细胞的益生作用。结果表明,在受到嗜水气单胞菌的感染时,枯草芽孢杆菌Ch9能诱导Caco-2细胞发生细胞凋亡并与外源性凋亡途径有密切的关系。综上所述,这些结果表明了枯草芽孢杆菌Ch9对肠上皮细胞有一定的保护作用,在肠道受到致病菌的侵袭时,能诱导肠道细胞发生凋亡,这可能是益生菌的一种保护机制。