研究背景和目的胃癌是世界上第四大常见恶性肿瘤,癌症致死率居第二位。目前胃癌的治疗仍然是以手术为主的综合治疗,然而,即使是最大限度的三联疗法,胃癌的预后仍然很差,进展期胃癌中位生存时间为10-14个月。而且手术只是从形态学上消灭已经发生的肿瘤,不能从根本上防止或抑制肿瘤的发生。基于肿瘤发生机制的靶向治疗已被看作是近三十年来人们在癌症病因学方面对机制研究取得显著进步的标志性成果之一。每一种靶向药物都是针对肿瘤细胞的某一个特定的功能,其特点就是特异性强,缺点是作用都是暂时的,之后不可避免的会出现肿瘤复发。复发原因之一是肿瘤的某一种标志性功能通常是由多条信号通路调控的,而一个靶向药物只抑制了其中一条关键通路;复发原因之二是癌细胞适应性的从对某一特定功能的依赖向对另外一种功能依赖的转变,从而限制了靶向药物的疗效,这是肿瘤复发的又一重要原因。这也提示我们在开发药物和设计治疗方案时,将癌细胞不同的特定功能和与每一种功能相关的多条生化通路综合到一起考虑是有益的。到目前为止,尚没有任何一种药物可以持续有效作用,最终不可避免的会出现耐药,而且也没有任何一种药物可以完全抑制肿瘤的生长。这就要求我们继续寻找更多的通路,更多的靶点,开发更多的靶向药物,选择性的同时靶向多个核心和特定功能,联合用药,对于治疗肿瘤将会更有效,更持久。代谢的改变在肿瘤发生发展过程中的重要作用越来越明白,在每个被研究的多细胞生物中都有很多关于信号通路和代谢调控之间存在交联的证据,代谢直接或间接地参与了细胞的每一个活动。癌基因的激活和抑癌基因的失活直接影响癌细胞的代谢和生长。p53作为一个抑癌基因,近年来在代谢调节方面的作用逐渐被重视。p53可以通过调控下游多个基因来调节代谢,通过激活SCO2/GLS2/Parkin来促进氧化磷酸化,通过抑制GLUT1/3/4阻断葡萄糖的摄取,通过促进TIGAR表达来抑制糖酵解。总体上p53抑制肿瘤的作用与其在代谢方面的作用有关,但在代谢应激的时候可以通过降低ROS水平和维持能量动态平衡,对于正常细胞和肿瘤细胞都是有保护作用的,p53的作用类似一把双刃剑。TP53诱导酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator gene,TIGAR）是在p53活化后通过基因表达微阵列分析发现的,作为p53的靶基因,作用与其类似,具有两面性,既有通过抑制糖酵解发挥抑制肿瘤的作用,同时又可以通过抑制ROS聚集,增加GSH:GSSG比值,增加核苷的合成来发挥促进肿瘤细胞增殖和再生的功能。而且TIGAR对糖酵解和ROS的调节作用依赖于细胞类型,这也是肿瘤异质性的一个表现,不同的肿瘤和同一肿瘤内部不同部位,其代谢方式是不完全相同的。目前已有TIGAR在脑胶质瘤、肝癌、头颈肿瘤、骨肉瘤、乳腺癌、血液系统疾病及结肠癌中的作用的研究,TIGAR在胃癌中作用的研究尚未见报道。TIGAR在胃癌中的表达的研究已有报道,但仅有其在肿瘤中的表达情况的结果而无正常对照,且未进行更深入的功能和机制研究。TIGAR除了受p53调控之外,也参与其他的一些信号 通路。在鼻咽癌细胞中,抑制C-Met,导致TIGAR蛋白表达更低,NADPH下降和细胞死亡增加,另外,在HeLa细胞中也证明TIGAR蛋白的表达受PI3K-AKT-mTORC通路的调控。AKT是被整合素活化的一个下游的丝氨酸苏氨酸激酶,参与细胞的凋亡抑制、增殖、转移以及多个其它进程。AKT2的激酶结构域的体细胞突变在人类癌症中广为报道,其过度激活是人类恶性肿瘤中最常见的分子表现。胃癌中,AKT和pAKT的表达在肿瘤中的检出率分别是74%和78%。在一个50例进展期胃癌的报告中,pAKT表达与肿瘤浸润深度、淋巴结受累数量以及不良结局有显著相关性。核pAKT表达也被发现与凋亡指数呈负相关。这条通路不仅在胃癌的生物学上有重要意义,同时也参与了 TIGAR的调控。本研究拟通过免疫组化和Western blotting方法检测胃癌组织及癌旁组织标本中TIGAR表达情况;并通过组织芯片技术探讨TIGAR与肿瘤分期及预后等的相关性;构建TIGAR敲低的胃癌细胞系进行体外实验,探讨TIGAR对于胃癌生长的作用,并进一步研究探讨其作用机制。方法第一部分:首先采用免疫组化和Western blotting方法检测胃癌组织及癌旁标本中的TIGAR表达情况,发现TIGAR在胃癌组织中表达升高,并进一步在组织芯片中检测了其表达情况及与肿瘤分期和预后的关系。第二部分:采用胃癌细胞株在体外进行TIGAR的功能实验,采用慢病毒转染的方法构建TIGAR敲低和过表达的细胞系,然后分别用MTT法检测细胞生长情况,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力及生长速度,用流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡情况,体内成瘤实验检测TIGAR对成瘤能力的影响。第三部分:检测TIGAR敲低后pAKT、Cyclin D1、BCL-2等蛋白以及NADPH和ROS的变化以探讨其作用机制。统计学处理采用Kaplan-Meier生存分析法和log-rank统计检验进行生存期单因素分析,P值<0.05为差异有统计学意义;卡方检验分析TIGAR在癌和癌旁组织中的表达情况,P<0.05为差异有统计学意义。Western blotting 结果通过 Image Studio Lite,PS,AI 进行数据处理,通过prism5,SPSS 22.0对实验结果进行统计学处理和分析。结果第一部分:TIGAR在胃癌组织中的表达及与临床预后的关系1.TIGAR在人胃癌组织标本中高表达。Western blotting检测32例临床新鲜胃癌标本及癌旁对照中,有18例标本TIGAR表达在癌组织中要高于癌旁组织。免疫组化检测42例石蜡标本中,TIGAR蛋白表达水平在癌组织中要显著高于癌旁组织（采用卡方检验,P<0.01）。2.TIGAR表达与胃癌病人生存期显著相关,其高表达与不良预后相关。结果显示,TIGAR高表达组与低表达组病例在平均年龄（P=0.04）,肿瘤病理N分期（P=0.002）,临床AJCC分期（P=0.015）之间有显著差异,且具有统计学意义;TIGAR相关的单因素多因素结果分析显示胃癌病人生存期与病人年龄（P=0.034）,肿瘤大小（P=0.036）,组织学分级（P=0.001）,肿瘤 T 分期（P=0.008）,N分期（P=0.000）,M分期（P=0.014）,临床AJCC分期（P=0.000）,TIGAR表达（P=0.034）之间有显著相关性;TIGAR高表达的病人的生存期显著低于TIGAR低表达组病人（P=0.033）。第二部分:TIGAR在胃癌细胞中的功能研究1.TIGAR在人胃癌细胞株中存在高表达现象。2.TIGAR敲低抑制体内体外AGS和SGC7901细胞增殖和克隆形成。体外实验证明,TIGAR敲低后的细胞生长明显减慢,TIGAR过表达组增殖加快;克隆形成实验表明TIGAR敲低的细胞系其克隆形成能力明显减弱,而过表达组克隆形成能力增强。体内成瘤实验结果显示从一开始TIGAR敲低细胞的成瘤速度就要比未敲低细胞慢,且从14天开始,对照组生长速度明显加快,而TIGAR敲低组肿瘤生长速度比较平缓。3.TIGAR提高癌细胞拮抗氧化应激的能力,增加胃癌细胞对糖酵解抑制剂的敏感性。结果显示,凋亡细胞的比例在经H202处理后,在早期和总的凋亡分区里是增高的（P<0.05）。同时,凋亡细胞的百分比在TIGAR被敲低后的细胞中,在早期和总的凋亡分区里也是显著增高的（P<0.001）。这些结果表明,TIGAR保护细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡。TIGAR敲低和2-DG联合应用显著增加了细胞凋亡。结果表明TIGAR低表达使胃癌细胞对糖酵解抑制剂的敏感性增加。4.TIGAR敲低诱导体外SGC7901和AGS细胞G2/M期周期阻滞。用流式细胞术检测SGC7901细胞周期分布结果显示,G0/G1,S,G2/M期细胞比例分别为53.4%,30.21%,16.07%;将TIGAR敲低后,结果显示在SGC7901 shRNA TIGAR B6 组中,G0/G1,S,G2/M 期细胞比例分别为 47.13%,28.55%,23.98%;在SGC7901 shRNA TIGAR B5 组中,G0/G1,S,G2/M 期细胞比例分别为 50.69%,27.09%,22.07%。与正常SGC901细胞相比,TIGAR敲低后,G0/G1期细胞比例显著减少（p<0.01）,G2/M期细胞比例显著增多（p<0.05）,S期细胞略有增多,表明细胞被阻滞在G2/M。在AGS细胞系中也观察到G2/M期细胞显著增多（p<0.05）。第三部分:TIGAR在胃癌细胞中作用的机制研究1.TIGAR敲低导致NADPH产生减少和ROS生成增加,从而诱导细胞凋亡。结果显示,TIGAR敲低后显著减少了 NADPH的产生,导致细胞NADPH/NADP+比率下降,ROS生成增加。与体外实验结果一致,体内数据表明TIGAR敲低后显著减少了体内成瘤标本中NADPH/NADP+的比率（p<0.05）,说明TIGAR敲低后,细胞磷酸戊糖通路受到抑制,致使NADPH产量减少,ROS生成增加,从而诱导细胞凋亡。2.TIGAR敲低减少Cyclin D1表达,诱导SGC7901和AGS细胞周期阻滞,减少BCL-2表达诱导细胞凋亡。体外实验结果表明,TIGAR敲低后,BCL-2以及Cyclin D1有明显的表达下降。从体内成瘤的标本里提取蛋白检测,与体外实验的结果一致,在检测的蛋白中,BCL-2以及Cyclin D1有明显的表达下降。结论1.TIGAR在大部分胃癌组织中高表达,其高表达与胃癌不良临床预后相关。2.TIGAR在人胃癌细胞株中存在高表达现象。3.TIGAR敲低通过NADPH产生减少、ROS生成增加、BCL-2表达下调从而诱导SGC7901和AGS细胞凋亡。4.TIGAR敲低通过减少Cyclin D1表达诱导SGC7901和AGS细胞周期阻滞从而抑制细胞增殖。5.TIGAR敲低增加胃癌细胞对糖酵解抑制剂的敏感性。