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目的:H型高血压为伴有高同型半胱氨酸血症(homocysteine,Hcy)的原发性高血压,近年来越来越受到人们的重视,它以血Hcy水平增高为特点(Hcy≥10μmol/L),是动脉粥样硬化的独立危险因素,与外周血管病变、脑血管病变、高血压、高血压性心脏病、冠状动脉阻塞及血栓形成的发生密切相关。人类亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是叶酸代谢中的关键酶之一,可将还原型辅酶I(NADPH)相关的5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸,这一代谢途径的正常运转在维持血浆中同型半胱氨酸正常水平中至关重要。MTHFR常见的突变为677位碱基C被T置换,产生Ala 222 Val错义突变,这一突变位于叶酸结合结构域。MTHFR的C667T错义突变,可降低血液中5-甲基四氢叶酸水平和升高Hcy水平,从而干扰DNA合成和损伤修复,引发包括H型高血压在内的多种疾病。因此,本课题组开展的在高血压患者中筛查MTHFR基因多态性十分必要,但是现有临床使用的SNP位点检测,常为一代测序,耗时长,成本高,已经满足不了临床检测的需要,也不适合大规模用于MTHFR C667T的流行病学调查研究。高分辨率溶解曲线分析技术(High Resolution Melting,HRM)是结合饱和荧光染料、未标记探针和实时荧光定量PCR的一种新的检测基因突变与基因分型的分子诊断技术,具有高通量、低成本、简单快捷、准确、灵敏度和特异性高和真正闭管操作等优点。其次,传统DNA样本往往从血液中抽提DNA,即收集病人的血样标本,这种方法有几个明显的缺点:需要具备医务人员及一定的采血设备;抽血的疼痛造成排斥拒绝采样;侵入性采集增加了感染的可能性;采集后血样必须低温运输保存。而从唾液中抽提DNA可以避免以上缺点,可提供无疼痛、非侵入性的方法,无需忍受抽血的疼痛和感染的风险,即可获得高质量、高数量的样品,受测者排斥性低,婴儿和老人都能方便地获得DNA样本。因此,本课题旨在将唾液抽提dna和hrm技术结合起来,建立一种快速检测mthfr基因c677t多态性的方法。研究方法:收集2014年1月--2014年7月在我院心血管内科门诊治疗的500例高血压患者,再从我院体检中心选取500例健康人员为健康对照组,每人收集唾液2ml及全血200ul,使用昌美生物的just-a-tubetm唾液dna提纯试剂盒提取唾液dna,使用上海凡济生物科技有限公司的全血dna抽提试剂盒提取全血nda,测定两者抽提dna的od260/280比值并比较,评估从唾液抽提dna用于后续hrm法的可行性。根据genbank上mthfr的基因序列,采用引物设计软件primer5设计mthfrsnp位点c.677c>t的特异性引物以及测序引物,优化反应条件,直接应用bio-radcfxmanager进行pcr扩增以及hrm分析。并将扩增产物进行测序,比较两种方法的灵敏度和特异性。采用edta抗凝管收集患者空腹静脉血4ml,测定血hcy和叶酸水平,高血压患者根据mthfrc667t不同基因型分为cc、ct、tt型,比较三组之间hcy和叶酸水平,初步探讨mthfrc667t基因多态性对hcy水平的影响。结果:1)唾液和血液dna浓度比较:我们用武汉昌美生物技术有限公司的唾液抽提dna试剂盒提取了500份高血压患者和500份正常对照组的唾液样本,抽提的dna均检测了od260/280的比值,结果显示,平均od260/280为1.809(95%ci1.791-1.827)。采用上海凡济生物科技有限公司的全血dna抽提试剂盒提取了500份高血压患者和500份正常对照组的全血标本,平均od260/280为1.823,95%ci1.720-1.854。唾液抽提出的dna纯度与全血抽提的dna结果纯度相近。2)成功构建一种快速检测mthfr基因c677t多态性的hrm法:hrm法引物:forwardprimer,tgaggctgacctgaagca,reverseprimer,tgtcagcctcaaagaaaa。20μl反应体系中最佳反应体系为:引物浓度0.8μmol/l,2×evagreenpremix10μl,dna5ng,双蒸水4.2μl。设定程序为两步法real-timepcr:预变性95℃,1分钟;之后每一步变性95℃,5s;退火延伸60℃,20s;共进行40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。HRM分析条件:PCR结束后从65℃开始到95℃,循环上升0.2℃,维持20 S,并检测荧光。3)MTHFR C667T HRM法检测结果与测序结果比较:1000例受试者用本研究建立的HRM法检测出270例(27.0%)CC型,425例(42.5%)CT型和305例(30.5%)TT型。1000例样本再用测序检测,结果提示,268例(26.8%)CC型,426(42.6%)CT型和306例(30.6%)TT型。HRM法有两例检测结果与测序结果不符,准确率为99.8%。4)不同分型的高血压患者血浆Hcy和叶酸水平比较:MTHFR C667T根据不同基因型分为CC、CT和TT型,TT型高血压患者血浆Hcy水平明显高于CC型和CT型(P<0.01),叶酸水平,CT和TT型显著低于CC型(P<0.01)。研究结论:1本研究将无创的唾液抽提DNA法应用于HRM前的DNA抽提纯化,并证实了其可行性,减轻患者采血取样的痛苦;2通过测序技术对HRM筛查结果的验证,初步证实了HRM技术在MTHFR C667T基因多态性临床筛查应用的可行性;3初步验证了MTHFR C667T基因多态性对高血压患者Hcy水平的影响。