背景成纤维细胞分化成特异性表达α-SMA的肌成纤维细胞并分泌大量细胞外基质是心肌纤维化的标志。而纤维状Ⅰ型胶原蛋白是心肌纤维化中主要的细胞外基质。纤维状Ⅰ型胶原蛋白和成纤维细胞在心肌纤维化发生发展中相互作用,互为因果,进一步加重心肌纤维化进程。在其中α2β1整合素作为细胞受体介导成纤维细胞和细胞外基质间的"交流"。然而目前为止,纤维状Ⅰ型胶原蛋白(FC)如何经由α2β1整合素调控成纤维细胞的机制仍无定论。为此我们在体外建立三维细胞模型,模拟心梗后体内纤维化环境,从而观察纤维化Ⅰ型胶原蛋白对成纤维细胞表型及α2β1整合素相关分子信号通路影响。目的探讨纤维状Ⅰ型胶原经由α2β1整合素介导成纤维细胞表型转化的相关分子通路机制材料方法1.成纤维细胞分离与培养心脏成纤维细胞从3月龄C57BL/6雄性小鼠心脏分离提取。本试验采用第三代细胞。2.三维纤维状Ⅰ型胶原蛋白培养基建立将Ⅰ型胶原蛋白溶液(1.25ml)中加入0.5ml的5×DMEM,并通过1%胎牛血清将其稀释至1×DMEM。3.细胞系GD25是null-α2β1整合素的成纤维细胞,GD25α2β1 integrin细胞是GD25细胞重组α2β1整合素在成纤维细胞中的表达。4.细胞迁移试验。细胞迁移试验是以细胞阻抗传感(ECIS)(Applied BioPhysics,Troy,NY,USA)为基础实时研究组织培养中细胞活性的方法。迁移由独立评估测量持续20小时。5.脉冲追踪法PTEN基因以35S蛋氨酸定量标记并以beta-actin进行免疫印迹测定蛋白的表达。6.PP2A磷酸酶活性测定PP2A的活性根据制造商的指示(Millipore,Temecula,CA,USA)通过磷酸化K-RpT-I-R-R进行去磷酸化评估。7.增殖试验细胞接种于含10%胎牛血清的培养基中培养1天。第4天,细胞被胰蛋白酶消化和计数后收获。8.数据分析所有实验最低重复三次。数据表示为平均值。免疫印迹的数据由BioSpectrum Imaging 系统(UVP,Upland,CA,USA)测定。所有的结果进行双侧分析,未配对t检验。P<0.05具有统计学意义。结果1.纤维状Ⅰ型胶原蛋白促进成纤维细胞分化及增殖为了探究纤维状Ⅰ型胶原蛋白对成纤维细胞的影响,将成纤维细胞种植在FC中。形态学观察示FC中的成纤维细胞形态较对照组更加纤长,通过细胞增殖能力及移形能力检测,发现FC中的成纤维细胞明显高于普通对照组,α-SMA的表达明显增高。同时将FC,PP2A抑制剂,TGFβ1这些因素同时处理细胞,结果提示相比其他因素FC促进成纤维细胞分化及增殖能力更强。2.纤维状Ⅰ型胶原蛋白降低成纤维细胞中a2β1整合素及PTEN表达western blot提示FC中的成纤维细胞a2β1整合素、PTEN含量明显少于普通对照组,而p-Akt及α-SMA则有所增高。分离心梗模型小鼠中梗死区域及非梗死区域成纤维细胞,结果提示梗死区域肌成纤维细胞中β1整合素明显低于正常组织成纤维细胞。接着通过半定量RT-PCR方法分别检测了 FC及TC中成纤维细胞a2β1整合素及PTENmRNA的含量。结果示与对照组相比无论a2或β1整合素mRNA含量都明显下降。然而PTEN mRNA的含量在两组间却没有明显改变。进一步我们通过Pulse-Chase assay方法检测PTEN蛋白稳定性,结果提示我们与正常对照组相比FC中的PTEN含量明显降低。3.敲低a2β1整合素可以促进纤维状Ⅰ型胶原介导肌成纤维细胞分化及增殖低表达β1整合素的成纤维细胞在FC中的增殖能力明显高于正常对照组,其PTEN含量明显降低,而其下游通路p-Akt含量及α-SMA含量明显增高。为了进一步明确PTEN的功能,通过RNA干扰技术敲低和过表达成纤维细胞中PTEN的含量。对于敲低组,与正常对照组相比在FC中的增殖能力明显增高(p<0.001),而a2β1整合素蛋白与对照组相比表达没有明显改变,但p-Akt及α-SMA蛋白表达增高。4.纤维状Ⅰ型胶原介导a2β1整合素调节PP2A活性而PP2A是否参与到Ⅰ型胶原经由a2β1整合素介导的成纤维细胞表型转化中?。通过对PP2A活性检测发现与对照组相比FC中的成纤维细胞中PP2A蛋白活性明显降低(p<0.002),接着我们敲低成纤维细胞中β1整合素表达。结果显示低表达β1整合素PP2A活性明显低于正常对照组(p<0.004)我们分别将GD25 α2β1 integrin-null(GD25)成纤维细胞和 GD25 α2β1 integrin 重组成纤维细胞种植在FC中,GD25成纤维细胞内PP2A的活性显著降低。而GD25 α2β1 integrin重组成纤维细胞中PP2A的活性明显增高(5-fold)。5.PP2A调节纤维状Ⅰ型胶原介导的成纤维细胞表型转化通过对细胞增殖分析,发现无论OA+组还是shRNA PP2Ac组成纤维细胞在FC中增殖明显高于对照组。shRNAPP2Ac组细胞中PP2Ac表达较对照组相比下降79%,然而PTEN表达却轻微减少;同时我们有趣的发现shRNAPP2Ac组细胞中p-Akt含量却明显升高(3.8-fold),同时也观测到α-SMA含量明显增加。接着我们将成纤维细胞种植在FC上,用OA处理细胞,同时设立对照组,观测0小时,0.5小时变化。结果提示0.5小时后OA(+)及OA(-)成纤维细胞中PTEN较0小时相比表达减少。然而0.5小时OA(+)及OA(-)成纤维细胞两组间PTEN表达差异不明显,同时OA(+)组中p-Akt和α-SMA表达却显著升高(分别3.93fold,5.7fold)。上述结果提示我PP2A主要靶点是Akt而不是PTEN。我们将种植在FC上的成纤维细胞分为三组,分别为予wortmannin(an AKT inhibitor),U0126(anERKinhibitor),wortmannin+U0126处理,抑制ERK后,细胞增殖轻微减少(p>0.05),而抑制了 AKT后,细胞增殖显著减少(p<0.01),而如果同时抑制ERK和AKT后细胞增殖减少更加明显(p<0.001)。以上结果提示我们相比于单独ERK通路,Akt通路在成纤维细胞分化和增殖调控中起的作用更明显。结论本研究证明了纤维状Ⅰ型胶原蛋白可以经由低表达的α2β1 integrin促进成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化。而AKT的过分激活,可能与PTEN及PP2A低活性相关。因此,我们可以认为α2β1integrin/PTEN/PP2A信号通路在纤维状Ⅰ型胶原介导的成纤维分化中起到重要的作用。