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大肠杆菌是存在于人体和其它高等动物肠道内的正常菌群。属于条件致病菌,在宿主免疫力低下或者菌群感染寄主肠道以外其它地方时候能引起胃痛、呕吐、腹泻和菌血症等病症反应。大肠杆菌细胞表面含有脂多糖成分,脂多糖由类脂A、核心多糖和O特异多链组成,其中类脂A是内毒素成分,O特异多糖链即O抗原是大肠杆菌致病性的基础。
控制O抗原合成的基因在大肠杆菌染色体上多成簇存在,相关的基因可以分为:单糖合成酶基因、糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。分别负责O抗原寡糖链中的单糖单位合成、转移和聚合。大肠杆菌主要通过Wzx/Wzy途径、ABC转运途径和合酶途径合成O抗原。O抗原可以作为大肠杆菌的分类标识,目前根据不同的O抗原可以把大肠杆菌分为180多个血清型。而大肠杆菌O抗原基因簇中种类繁多的糖基转移酶、单糖合成酶和寡糖单位处理酶基因为人类需要的寡糖分子的生物合成提供了丰富的基因资源。
本论文结合实验室的前期工作和实验基础,选择大肠杆菌O107和O117的wclY基因,大肠杆菌O6orf3,O23 orf6,O78 orf1,O88 orf11和O126 wbgK基因作为研究的对象。大肠杆菌O107的O117的O抗原多糖链早已被破译,两株菌株的多糖链只有一个糖单位不同,在比对分析两株菌株的O抗原基因簇发现只有wclY基因有部分序列不同,所以我们预测大肠杆菌O107和O117的wclY基因各自负责这两株菌株中那个不相同的糖单位的连接。本研究中,我们利用同源重组缺失的原理构建O107和O117的wclY基因的缺失型菌株,用氯霉素基因代替正常的wclY基因获得缺失型菌株。然后再将O107和O117的野生型welY基因分别回补至O107和O117的wclY基因缺陷型菌株中,通过核磁分析回补菌株的多糖链结构,从而验证了这两个基因的功能。本课题中我们还构建了O6orf3,O23 orf6,O78 orf1,O88 orf11和O126 wbgK基因的原核表达克隆,研究确定了O6 ORF3,O23 ORF6,O78 ORF和O88 ORF11蛋白的最佳表达条件,并纯化了O88 ORF11蛋白。为以后体外生化手段鉴定这几个基因的功能奠定了基础。