结直肠癌是恶性肿瘤中较常见的类型之一,预后较差,5年生存率小于50%,IV期患者则不超过10%。在我国,随着生活方式和饮食习惯的改变,结直肠癌的发病率逐年上升,已跃居各种恶性肿瘤发病率的第四位。由于其发病原因不清,而且,早期症状不明显,初次发现时已有25%的患者发生转移,另外的75%患者即便能够手术切除,但仍有1/2左右出现复发、转移,这部分患者的预后较差,虽然各种抗癌药物的应用在一定程度上取得一些疗效,但因抗癌药物的副作用和肿瘤对药物产生耐受等,往往难以达到治疗目的。因此,早期发现、早期诊断、早期治疗仍是提高结直肠癌治愈率的基本策略,而寻找有效的早期诊断或治疗的特异性标志物则是基础和临床医学、生命科学工作者的长期目标。随着对癌症发生分子机制的深入研究,发现了一些与肿瘤发生进展密切相关的分子,以此为靶点的肿瘤疫苗、单克隆抗体和小分子药物抑制剂等成为治疗肿瘤的新的手段。其中,单克隆抗体倍受人们关注,因它能够与肿瘤组织细胞的抗原成分特异性结合,介导杀伤肿瘤细胞,并能避免对正常组织的损害,成为恶性肿瘤诊治的有效策略之一。目前,应用单克隆抗体结合药物利妥西治疗淋巴肿瘤取得了较好的效果,但对实体瘤效果不甚理想,可能与实体瘤的分子异质性,难以找到普遍特异的分子靶点有关,例如,常用于结直肠癌的依决洛单抗(edrecolomab, MAb 17-1A)、贝伐单抗(bevacizumab, Abastin)和西妥西单抗(cetuximab, IMC-C225),虽能提高部分晚期结直肠癌患者的生存期5-11月,但应用范围和疗效均较有限,可见结直肠癌单克隆抗体的研发也面临同样的问题。因此,制备针对结直肠癌较特异和敏感的单克隆抗体,用于临床相关疾病的诊断和治疗将具有重要的现实意义和广阔的应用前景。目前针对结直肠癌的单克隆抗体均是采用肿瘤细胞系免疫动物,制备的单克隆抗体的特异性普遍不高;为克服这一问题,本研究拟从优化抗原和改进筛选方法入手,采用新鲜的结直肠癌患者手术标本,包括高、中、低分化结直肠癌,直接分离肿瘤细胞免疫动物;在筛选方法上,避免了传统的ELISA方法,而采用结直肠癌组织标本的免疫细胞化学染色筛选针对肿瘤组织的特异性单克隆抗体,具有一定的直观性和特异性,可能更接近于患者体内肿瘤抗原的真实表达情况。本研究主要结果如下:(一)细胞融合及特异性单克隆抗体的获得制备结直肠癌细胞悬液免疫小鼠,共免疫6只动物,经检测血清针对结直肠癌的抗体效价明显升高后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,三次融合共获96个细胞克隆,免疫细胞化学染色结果表明,与结直肠癌组织反应阳性的克隆为32个。本研究选择免疫染色特异性强、细胞克隆生长良好的2个克隆(分别命名为2-3和15-8)进行单克隆化、扩大培养,进一步鉴定结果表明2-3单克隆抗体的特异性较15-8的高,故我们主要对2-3单克隆抗体进行了较细致的实验研究。(二) 2-3单克隆抗体的组织特异性检测收集30例原发性结直肠癌手术切除标本、20例其它肿瘤标本、肺癌细胞系和结直肠癌细胞系以及正常组织(对照用),采用间接免疫酶细胞化学染色法显示相应抗原的分布,同时与已知的市售CEA抗体染色结果对比分析。2-3单克隆抗体(培养上清和腹水),在30例结直肠癌组织冰冻切片中效价高达1:150000,阳性率为100%,癌组织的染色强度和阳性比例远高于癌旁的黏膜组织(P<0.05);不同分化程度的结直肠癌组织,以中、低分化腺癌的抗原表达量为多,其反应阳性物质主要存在于腺癌的腺管管腔和细胞质内,表明该抗体识别的抗原可能主要为癌细胞分泌的蛋白成分。结直肠癌标本的石蜡切片免疫染色结果与冰冻切片相似,但染色强度稍弱,而且,抗体效价较冰冻切片低,约为1:100000左右。在癌旁组织中,可见食管、胃、结直肠、肝内胆小管呈弱阳性反应,但阳性率非常低,而且,染色范围仅局限于上皮表层;其它正常组织,如小肠、胆囊、肺、脑、脾、乳腺、肌肉、结缔组织、红细胞、粒细胞以及淋巴细胞等,均未见阳性反应。与其它癌组织及结直肠癌转移标本的免疫染色结果呈不同程度的阳性,其中,食管癌1例阳性(1/2),胃癌3例阳性(3/3),肝细胞癌4例阳性(4/4),肺癌6例阳性(6/7),乳腺癌阴性(0/2),结直肠癌肺转移1例阳性(1/1),结直肠癌脑转移1例阳性(1/1)。阳性产物主要分布于腺癌的癌细胞、鳞癌的癌巢中心和印戒细胞癌,而所有肿瘤组织的间质成分均为阴性。该抗体与肺癌细胞系A549和结肠癌细胞系SW480均呈阳性反应。与已知的市售CEA抗体染色结果对比分析表明,2-3单克隆抗体所识别的抗原成分与CEA相似,均在结直肠癌、肺癌和胃印戒细胞癌中表达较多,但2-3单克隆抗体较CEA染色特异性强,效价高(CEA的稀释度最高为1:8000左右)。(三)核型检测、western blot和抗原性质分析本研究所获得的两株杂交瘤已连续培养9个月,至今仍保持良好的抗体分泌能力,冻存复苏后亦能分泌大量抗体,腹水产生效果良好,染色体检查符合杂交瘤细胞的基本特征。Western blot结果显示结直肠癌提取的蛋白在180KD处与CEA反应有一清晰的条带,而与2-3单克隆抗体反应条带不明显。抗原经SDS和β-巯基乙醇混合加热后,与2-3单克隆抗体点杂交的阳性反应消失,与CEA点杂交的阳性反应不变,提示2-3单克隆抗体识别的抗原表位可能与CEA识别的抗原构象有所不同。结直肠癌组织切片经1%高碘酸钠处理后,对2-3单克隆抗体和CEA染色的阳性部位和阳性面积无明显影响,而经0.25%胰酶处理后,与二者的阳性反应消失,提示两种抗体所识别的抗原主要为蛋白类抗原,但有关2-3单克隆抗体所识别的抗原性质仍需进一步实验研究。阐明上述问题,对于应用该抗体作为实验工具,研究相关蛋白在结直肠癌及其它肿瘤发病中的作用机制具有重要意义。