Bevacizumab是针对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)人工合成的一种重组人源化单克隆抗体。目前已被美国FDA批准为转移性结直肠癌的一线、二线治疗,非小细胞肺癌的一线治疗,转移性HER2阴性乳腺癌的治疗。近期多项研究Bevacizumab对肝癌的临床疗效的Ⅰ期、Ⅱ期临床试验的结果表明Bevacizumab单药以及联合其他化疗药物或分子靶向药物都有一定的抗肿瘤疗效。肿瘤的血管生成是一个多步骤复杂过程,需要大量的生长因子,这些生长因子对肿瘤新生血管的形成、肿瘤的生长和转移是很重要的。肝细胞癌是多血管性的肿瘤,研究发现肝细胞癌中存在高水平的VEGF和微血管密度,而且VEGF的高表达与患者的预后呈负相关。VEGF是在肿瘤血管生成中起核心作用的正调节因子。VEGF对血管内皮细胞的作用是通过与其特异性受体VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)结合实现的。目前,Bevacizumab的疗效都归功于它通过阻断VEGF与内皮细胞上的VEGF受体结合来抑制内皮细胞的增殖。然而,抗VEGF治疗是否也可能对肿瘤细胞本身有直接作用却了解甚少。近年研究发现,多种肿瘤细胞自身也存在VEGF受体的表达,外源性VEGF可通过肿瘤细胞上的VEGF受体作用于肿瘤细胞。已证实白血病、黑色素瘤、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌上均可见VEGF受体表达,并在这些肿瘤细胞上存在VEGF的自分泌机制。已有一些研究表明,肝癌细胞系中也存在Flt-1、KDR的表达,各细胞株受体表达情况不一,且通过抑制VEGF的表达后可显著抑制肝癌细胞的增殖,说明肝癌细胞中也可能存在VEGF的自分泌机制。由此推断,Bevacizumab也有可能通过阻断VEGF与肝癌细胞上的VEGF受体结合来抑制肝癌细胞的增殖。目前,单药Bevacizumab抗肿瘤治疗已有一定的疗效,但是多项临床前实验证明了Bevacizumab联合化疗药物治疗肿瘤比其单药治疗疗效好。近年世界上多个国家都在进行吉西他滨治疗肝癌的临床研究,但其单药有效率在20%以下。而Bevacizumab可增加传统化疗药物治疗实体瘤的疗效,包括结肠癌和非小细胞肺癌。近期也有多项临床研究证明了Bevacizumab联合吉西他滨或其他化疗药物治疗肝癌的有效性。因此,本研究旨在探讨Bevacizumab对人肝癌细胞的增殖影响及机制,Bevacizumab联合吉西他滨对荷肝癌裸鼠的治疗作用。第一部分肝癌细胞中血管内皮生长因子自分泌机制的实验研究一、研究方法和内容1、采用RT-PCR、免疫细胞化学的方法分析肝癌细胞株中VEGF、Flt-1、KDR基因和蛋白水平的表达:选用两株肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721,内皮细胞系ECV304作为VEGF受体表达的阳性对照,从中筛选VEGFmRNA表达量高,Flt-1、KDR均为阳性表达的肝癌细胞株,采用独立样本t检验统计分析。2、外源性rhVEGF对肝癌细胞的影响:无血清条件下,12.5ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml rhVEGF作用于肝癌细胞株HepG2细胞72h后,行MTT检测其增殖情况,并用单因素方差分析不同浓度rhVEGF对肝癌细胞株的促进增殖作用;通过RT-PCR检测100 ng/ml rhVEGF作用肝癌细胞后VEGF、Flt-1、KDRmRNA的表达量,与空白对照组比较采用独立样本t检验。二、主要结果1、RT-PCR结果示:肝癌细胞株HepG2中均有VEGF、Flt-1、KDRmRNA的表达,而SMMC-7721中只有VEGF、Flt-1mRNA的表达;且HepG2中VEGF、Flt-1mRNA的表达量均高于SMMC-7721(VEGFmRNA:t=9.056,P=0.001:Flt-1mRNA:F=55.975,P=0.000);免疫细胞化学结果示:HepG2见VEGF、Flt-1及KDR的表达,SMMC-7721见VEGF、Flt-1的表达,无KDR的表达。因此,我们选用VEGF高表达和Flt-1、KDR均表达的HepG2细胞作为研究Bevacizumab对肝癌细胞直接作用的实验用细胞。2、不同浓度rhVEGF对肝癌细胞株HepG2均有促进增殖的作用,12.5ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml组OD值与对照组差异均有统计学意义(P值分别为0.023,0.002,0.000,0.000)。在25-100ng/ml范围内其促进作用随rhVEGF浓度的增高而增强;其VEGF、KDRmRNA表达量均增加(t值分别为:22.450和9.086,P值分别为:0.000和0.001),而Flt-1mRNA表达量无明显变化(t=1.225,P=0.288)。三、主要结论1、人肝癌细胞株中存在VEGF及其受体的共同表达。2、rhVEGF对肝癌细胞株HepG2有促进增殖的作用,且呈剂量依赖性,此作用可能是通过KDR介导的,同时随着肿瘤细胞的增殖,其VEGF进一步表达,从而使得VEGF和其受体KDR的相互作用加强。3、肝癌细胞中可能存在VEGF的自分泌机制,且该机制是通过KDR介导的。第二部分Bevacizumab直接抑制肝癌细胞体外增殖的实验研究一、研究方法和内容1、MTT法检测Bevacizumab对肝癌细胞的增殖抑制作用:无血清条件下,0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20μg/mlBevacizumab作用于HepG2细胞48h,采用单因素方差分析(LSD法)比较不同浓度间及与对照组的增殖情况。2、Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡:无血清条件下,10μg/mlBevacizumab作用于HepG2细胞48h后,经Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞仪检测凋亡情况。采用独立样本t检验比较Bevacizumab组和对照组。3、流式细胞仪分析细胞周期变化:无血清条件下,10μg/mlBevacizumab作用于HepG2细胞48h后,PI染色,流式细胞仪检测,计算各期细胞所占比例。采用独立样本t检验比较Bevacizumab组和对照组。4、RT-PCR分析肝癌细胞株VEGF、Flt-1、KDRmRNA表达量的变化:无血清条件下,10μg/mlBevacizumab作用于HepG2细胞48h后,行RT-PCR检测。采用独立样本t检验比较Bevacizumab和对照组。二、结果1、不同浓度Bevacizumab对肝癌细胞株HepG2的增殖有抑制作用。0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml组细胞增殖抑制率分别为8.8%、27%、32%、26%。其中1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml组与对照组比较差异均有统计学意义(P值分别为0.001,0.000,0.001),但此三组间差异无统计学意义(P＞0.05)。2、Bevacizumab可诱导肝癌细胞株HepG2的凋亡。Bevacizumab组的细胞凋亡率为(17.044±0.14)%,明显高于对照组(2.85±0.08)%(t=198.533,P=0.000)。3、Bevacizumab可引起肝癌细胞株HepG2的细胞周期变化。其中,S期细胞无明显变化(t=0.477,P=0.646);G1期的细胞增加(t=13.457,P=0.000),G2期的细胞减少(t=16.787,P=0.000),差异均有统计学意义。4、Bevacizumab作用于肝癌细胞株HepG2后,其VEGF、KDRrnRNA表达量均减少,与空白对照组比较差异有统计学意义(t值分别为:12.476和5.071,P值分别为:0.000和0.007);而Flt-1mRNA表达量与空白对照组比较无显著差异(t=2.449,P=0.07)。三、结论1、Bevacizumab作用于肝癌细胞株HepG2后,细胞增殖受抑,细胞凋亡率增高。2、Bevacizumab对HepG2的增殖抑制作用可能是通过KDR介导的,同时随着肿瘤细胞的增殖抑制,其VEGF表达量减少。3、Bevacizumab可能通过阻滞VEGF的自分泌作用而发挥对肝癌细胞的增殖抑制作用。第三部分Bevacizumab联合吉西他滨对荷肝癌裸鼠的治疗作用研究一、研究方法和内容建立人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤模型,每隔3天观察一次,用游标卡尺测量肿瘤的大小,当肿瘤直径长至0.4～0.6cm时,即用于实验。实验分A组:空白对照组,予以无菌生理盐水,0.2ml/只;B组:Bevacizumab组,5mg/kg;C组:吉西他滨组,100mg/kg;D组:Bevacizumab5mg/kg+吉西他滨100mg/kg联合组。各组给药均为2次/周,共4周,腹腔注射。自接种后第19天起,每周检测肿瘤体积。连续给药4周后停药一周,处死裸鼠,取移植瘤组织进行CD34染色检测各组微血管密度(MVD)。对照组与各治疗组间移植瘤体积比较采用重复测量数据的方差分析;对照组与各治疗组间MVD的比较采用单因素方差分析。二、主要结果1、各治疗组给药后体积与对照组相比增长均较缓慢,Bevacizumab组、吉西他滨组、Bevacizumab联合吉西他滨组的抑瘤率分别为40.35%、45.61%、84.21%,其中Bevacizumab联合吉西他滨组最为明显。Bevacizumab联合吉西他滨与Bevacizumab、吉西他滨组之间均有显著差异(P值分别为0.004,0.010)。2、与对照组比较,单药吉西他滨组MVD无显著差异(P=0.267);单药Bevacizumab组及联合吉西他滨组的MVD均减少,与对照组比较差异均有统计学意义(P值均为0.000);Bevacizumab联合吉西他滨组的MVD减少较Bevacizumab组更为显著,差异有统计学意义(P=0.000)。三、结论1、Bevacizumab可抑制荷肝癌裸鼠移植瘤的生长,而联合应用吉西他滨可显著增加二者单药的治疗疗效。2、Bevacizumab主要通过抑制新生血管的形成而发挥治疗荷肝癌裸鼠的作用。