聚合酶链式反应(PCR)技术是一项基因检测技术,具有简便易行、灵敏度高等优点,已广泛用于核酸扩增及基因表达调控研究。其中,基因组DNA是传统PCR技术常用的扩增模板,制备方法通常有两种:利用常规生物化学试剂破碎细胞,从细胞提取核酸以获得基因组DNA;通过细胞裂解液或酶等直接破碎细胞,不进行核酸抽提而获得基因组DNA。前者是目前生物学常用的方法,但存在成本高、效率低等缺点;后者是近年来分子生物学领域发展的一种快速进行基因克隆及其表达调控研究的新方法,具有操作简便、成本低、耗时短等优点。故而,本课题将多重PCR技术与针对细胞或组织直接进行PCR的技术相结合,以秀丽线虫和大肠杆菌为对象,建立了一种快速相对定量线虫线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)拷贝数和大肠杆菌质粒拷贝数的新方法,具体应用过程分述如下:　　1、利用单线虫两重PCR技术对秀丽线虫mtDNA拷贝数进行相对定量的方法　　线粒体(mitochondrion)是真核细胞中具有双层膜结构的半自主性细胞器,通过氧化磷酸化作用合成ATP作为能量,供机体完成各种生理过程。线粒体除参与机体细胞能量转换外,还参与机体细胞分化、细胞信号传递和细胞凋亡等生命活动过程。当线粒体DNA突变或拷贝数发生变化时均将导致严重的线粒体疾病,如Leber遗传性视神经病和肌阵挛性癫痫等。因而,如何快速、高效地定量线粒体DNA拷贝数已成为线粒体相关研究的核心问题。目前常用的线粒体DNA拷贝数定量化研究的方法主要有RT-PCR法和实时定量PCR法,二者均依赖于总RNA的提取和反转录等过程,不仅成本高、操作繁琐,而且对昂贵仪器的依赖性较大。为此,基于单线虫PCR技术拟建立一种以细胞核基因组DNA为内参快速相对定量线粒体DNA拷贝数的方法,以期为线粒体DNA拷贝数的相关研究提供新的技术方法。　　2、利用多重PCR技术对质粒拷贝数进行相对定量的方法　　为深化多重PCR在基因拷贝数测定中的应用,我们对菌液直接进行多重PCR,对质粒拷贝数进行定量。首先利用多重PCR引物设计及评估体系分别针对细菌基因组DNA和质粒载体DNA序列设计五重PCR引物;然后以转化有不同质粒载体的大肠杆菌菌液为模板进行多重PCR反应;最后利用凝胶成像仪采集图像以获得质粒的相对拷贝数。结果显示通过多重PCR得到的质粒相对拷贝数与Real-timePCR的检测结果基本一致,说明多重PCR可用于质粒拷贝数的定性定量检测。因此,本部分利用多重PCR技术建立了一种便捷的质粒拷贝数检测方法,为在宿主细胞中快速确定克隆载体或表达载体的相对含量提供了参考。　　综上,本研究利用多重PCR技术与细胞或组织PCR技术相结合,建立了一种线粒体DNA拷贝数和细菌质粒拷贝数相对定量的新方法,不仅为多重PCR技术的应用提供了重要前景,而且为线粒体DNA拷贝数等的研究提供新的检测方法。