【摘 要】
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甲基转移酶（Methyltransferase,MT）是激活甲基循环的重要组成部分,在翻译的调节、对抗生素的易感性以及细菌胞浆内的膜的维护、次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢等方面起着重要作用。由甲基转移酶参与的生物大分子的甲基化,在维持DNA结构、蛋白功能和改变抗生素活性等方面也起着关键作用。同时IS作为原核生物最小的活性转座元件,在原核生物基因组的多样性起着一定的作用。而催化DNA转座的转
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甲基转移酶（Methyltransferase,MT）是激活甲基循环的重要组成部分,在翻译的调节、对抗生素的易感性以及细菌胞浆内的膜的维护、次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢等方面起着重要作用。由甲基转移酶参与的生物大分子的甲基化,在维持DNA结构、蛋白功能和改变抗生素活性等方面也起着关键作用。同时IS作为原核生物最小的活性转座元件,在原核生物基因组的多样性起着一定的作用。而催化DNA转座的转座酶含有保守的酸性氨基酸三联体[天冬氨酸（D）,天冬氨酸（D）,谷氨酸（E）]的DDE基序,可用于协调二价金属阳离子,这些阳离子在链断裂和重新结合期间发生的亲核攻击中起着至关重要的作用。DDE转座酶还包括DNA结合域,例如螺旋-转角-螺旋或锌指结构,以及多聚体形成所需的功能。因此对不同链霉菌中甲基化酶基因和DDE转座酶基因进行克隆、分析,为研究其在链霉菌次级代谢途径中发挥作用提供理论基础。本论文的研究内容与主要研究结果如下。（1）从实验室保藏的放线菌中分别筛选出产甲基转移酶的菌株A1和DDE转座酶的菌株X1,经生理生化、形态学特征鉴定,初步判断A1为链霉菌属白孢类群,而X1为链霉菌属灰褐类群。通过16S r DNA鉴定及构建系统进化树,分别确定为Streptomyces badius sp.A1和Streptomyces labedae sp.X1。（2）从Streptomyces badius sp.A1基因组DNA扩增出一约450 bp的DNA片段,通过与p MD19-T载体连接,转入XL-10 Gold感受态细胞,对重组质粒进行测序。生物信息学分析表明该扩增DNA序列长430 bp,与class I SAM-dependent methyltransferase（sequence ID:WP098019992.1）同源性为96%,建树分析比对,该序列为甲基转移酶基因,拟编码甲基转移酶结构域。该基因拟编码143个氨基酸,分子式为C638H1025N189O194S4,理论等电点为4.88,不稳定指数为26.14,为酸性稳定蛋白;无信号肽及跨膜区域,为非分泌蛋白;平均疏水性为0.133,为疏水蛋白;二级结构中主要以α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲为主;存在1个糖基化位点和9磷酸化位点;三维结构显示该蛋白主要以无规则卷曲和α-螺旋为主,对其生物学功能的发挥有重要作用。构建表达载体p ET32a（+）-MT,1 mmol/L IPTG低温诱导蛋白表达,SDS-PAGE显示该基因拟表达蛋白的分子量约33 k Da。为研究链霉菌甲基转移酶基因的表达机制提供了重要信息,对鉴定甲基转移酶活性以及它的结构和功能奠定基础。（3）从Streptomyces labedae sp.X1基因组DNA中扩增一约401 bp的目的基因片段,通过与p MD19-T载体连接,转入XL-10 Gold感受态细胞,对重组质粒进行测序。生物信息学分析显示,其长为401 bp,与ISAzo13家族转座酶的基因同源性为88%;该基因拟编码133个氨基酸,DDE转座酶的保守的氨基酸三联体分别位于Asp43、Asp49、Glu91,且该序列中存在一HTH结构域,证明该扩增片段为DDE转座酶基因片段。理化性质结果显示拟编码产物为稳定的亲水蛋白;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构域,为非分泌蛋白;有14个磷酸化位点且仅有一个糖基化位点;高级结构以α-螺旋为主;构建了表达载体p ET32a（+）-DDE,IPTG诱导下进行蛋白表达,SDS-PAGE显示该基因拟表达蛋白的分子量约27 k Da,与预测结果一致。本研究为研究链霉菌甲基转移酶基因和DDE转座酶基因的表达机制提供了重要信息,对以后鉴定甲基转移酶和DDE转座酶活性、酶学功能研究、晶体学解析以及它的结构和功能研究奠定基础。
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