论文部分内容阅读
目的:构建NASH大鼠模型,并以慢病毒为媒介实施在体干预,介导CMKLR1在大鼠肝组织中过表达,以期通过基础研究为临床治疗NAFLD提供方向。方法:以慢病毒为载体,鉴定其成功整合CMKLR1基因后以备在体干预。以42只雄性SD大鼠为研究对象,在适宜的光照、温度、湿度环境中适应性喂养1w后随机分为4组,模型组、对照组、转染组(SV-CMKLR1)各12只,空转染(CSV)6只,除对照组给予普通饮食外,其余各组均给予高脂饮食。在实验第1d,转染组于尾静脉注射携带CMKLR1基因的慢病毒2×109pfu 100微升;CSV组于尾静脉注射不携带CMKLR1基因的慢病毒2×109pfu 100微升;PBS作为尾静脉外源性注射物的对照体,各自给予模型组、对照组100微升。在实验的第7、14、21天分别从空染组取2只大鼠处死,显微镜下观察其转染细胞效率。跟踪大鼠一般情况,每周进行称重;分别在8W末、12W末随机从各组取6只大鼠,禁食12h后腹腔麻醉(麻醉药物选用水合氯醛),打开腹腔自腹主动脉取血,离心后留取上清液保存,观察肝脏大体形态变化,留取部分肝组织液氮冷冻后置-80℃冰箱冻存备用,同时取部分肝组织行HE染色,显微镜下观察并行NAFLD活动度评分;Real-time PCR检测各组大鼠肝组织中脂联素、CMKLR1 m RNA水平;Western Blot检测各组大鼠肝组织中CMKLR1、脂联素的蛋白水平。结果:(1)同期大鼠体重及肝指数相比较:模型组>对照组、模型组>转染组,差异均有统计学意义(P￡0.05)。(2)肝组织HE染色结果:对照组大鼠肝组织肝细胞排列整齐、沿条索呈放射状整齐分布、未见炎症细胞浸润或空泡样变;8w末时,可见模型组肝组织肝细胞体积呈现不同程度的增大、肝条索排列紊乱、可见气球样变,表现为单纯性脂肪变;12w末时,观察视野中几乎所有的肝细胞肿大,胞浆疏松,大量球形脂滴出现及大量炎细胞浸润,可见点状坏死及桥接坏死,进展为NASH;8w末时,转染组肝细胞镜下也表现为单纯性脂肪变、12w末时亦进展为NASH,但脂肪变性程度均较模型组轻。(3)同期血清中凯莫瑞水平作比较:模型组>对照组,但差异无统计学意义,转染组>模型组,差异有统计学意义(P￡0.05)。(4)同期血清中脂联素水平作比较:模型组<对照组;转染组>模型组,差异均有统计学意义(P￡0.05)。(5)PCR检测肝组织中CMKLR1mRNA及脂联素mRNA表达情况,同期比较结果显示:大鼠肝组织中CMKLR1水平:模型组>对照组,无显著统计学差异;转染组>模型组,存在显著统计学差异(P￡0.05);大鼠肝组织中脂联素表达情况:对照组>模型组,转染组>模型组,差异均有统计学意义(P￡0.05)。(6)Western Blot检测大鼠肝组织中CMKLR1及脂联素蛋白含量,同期比较结果显示:大鼠肝组织中CMKLR1蛋白含量模型组>对照组,无显著统计学差异;转染组>模型组,存在显著统计学差异(P￡0.05);大鼠肝组织中脂联素蛋白表达情况:对照组>模型组,转染组>模型组,差异均有统计学意义(P￡0.05)。结论:外源性注射携带CMKLR1基因的慢病毒,使CMKLR1在大鼠肝组织内过表达,可显著改善NASH时肝脏的病理学改变。